ヒザラガイの磁鉄鉱歯特異的な鉄酸化酵素の機能解明

• Project Area: Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
• Project/Area Number: 22H04812
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 根本 理子 岡山大学, 環境生命自然科学学域, 准教授 (30625926)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000); Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2022: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: ヒザラガイ / ヘファエスチン / 鉄酸化酵素 / 磁鉄鉱 / バイオミネラリゼーション

Outline of Research at the Start

軟体動物の一種であるヒザラガイは歯舌と呼ばれる摂餌器官を持ち、その歯冠部に磁鉄鉱を沈着させる。本研究では、申請者が同定した歯冠部特異的に局在する鉄酸化酵素について、遺伝子ノックダウン、組換えタンパク質を用いた活性評価、および抗体を用いた局在解析を行ない、同タンパク質の磁鉄鉱形成における役割を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

2023年度に遺伝子ノックダウン実験を複数回実施した結果、ノックダウン個体、および陰性対照ともに発現量のばらつきが大きい結果となった。ヘファエスチン様タンパク質の遺伝子は、これまで遺伝子ノックダウンを行った他の遺伝子に比べて歯舌組織における発現量が低く、ゲノムDNA混入の影響を大きく受ける事が明らかになった為、現在用いている歯舌組織からのRNA抽出方法の見直しを行い、より純度の高いRNAを多く抽出できる方法を検討した。また、RNAに混入したゲノムDNAの影響を最小限にするため、遺伝子ノックダウン後に発現量定量に用いている定量PCR用のプライマーについても、イントロンを跨ぐプライマーを再設計し、再度遺伝子ノックダウン実験を行っている。さらに今後の遺伝子ノックダウン個体の表現型解析のため、歯舌組織のPIXE（Particle Induced X-ray Emission）分析を実施した。その結果、PIXE分析によりヒザラガイ歯舌組織の鉄の分布を評価可能であることが示された。
GALプロモーターよりも強力なプロモーターであるWTC846プロモーターを用いて磁鉄鉱歯特異的フェロキシダーゼを酵母に組み換え発現させる系を構築した。組み換え酵母の破砕液を用いたフェロキシダーゼ活性評価の結果、GALプロモーターを用いた場合は全く活性が確認されなかったのに対し、WTC846プロモーターを用いて組み換え発現した場合に、わずかに時間依存的なFe2+の減少を示す結果が得られ、フェロキシダーゼ活性が確認された。そこでWTC846プロモーターを用いて組み換え発現させた磁鉄鉱歯特異的フェロキシダーゼの精製を試みたが、活性評価に用いる十分量のタンパク質を得ることができなかった。そのため、より多くの組み換えタンパク質が得られる昆虫細胞発現系に変更し、実験を進めている。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The Multiphasic Teeth of <i>Chiton Articulatus</i>, an Abrasion‐Resistant and Self‐Sharpening Tool for Hard Algae Collection (2024)
  • Author(s): Montroni Devis、Sarmiento Ezra、Zhao Ruoheng、Dasika Phani Saketh、Connolly John Michael、Wuhrer Richard、Zhang Yugang、Zhernenkov Mikhail、Wang Taifeng、Ramirez‐Santana Brenda Paola、Sheppard Leigh、Avila‐Poveda Omar Hernando、Arakaki Atsushi、Nemoto Michiko、Zavattieri Pablo、Kisailus David
  • Journal Title: Advanced Functional Materials Volume: 2401658 Issue: 33
  • DOI: 10.1002/adfm.202401658
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Nuclear Transformation of the Marine Pennate Diatom Nitzschia sp. Strain NIES-4635 by Multi-Pulse Electroporation (2023)
  • Author(s): Okada Koki、Morimoto Yu、Shiraishi Yukine、Tamura Takashi、Mayama Shigeki、Kadono Takashi、Adachi Masao、Ifuku Kentaro、Nemoto Michiko
  • Journal Title: Marine Biotechnology Volume: 25 Issue: 6 Pages: 1208-1219
  • DOI: 10.1007/s10126-023-10273-w
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] オミクス解析に基づく生体鉱物形成関連タンパク質の同定 (2023)
  • Author(s): 根本理子
  • Journal Title: 化学と生物 Volume: 61 Pages: 439-444
• [Journal Article] Mesocrystalline Ordering and Phase Transformation of Iron Oxide Biominerals in the Ultrahard Teeth of <i>Cryptochiton stelleri</i> (2022)
  • Author(s): Wang Taifeng、Huang Wei、Pham Cong Huy、Murata Satoshi、Herrera Steven、Kirchhofer Nathan D.、Arkook Bassim、Stekovic Dejan、Itkis Mikhail E.、Goldman Nir、Zepeda-Ruiz Luis、Freychet Guillaume、Zhernenkov Mikhail、Nemoto Michiko、Arakaki Atsushi、Kisailus David
  • Journal Title: Small Structures Volume: 3 Issue: 4 Pages: 2100202-2100202
  • DOI: 10.1002/sstr.202100202
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Nanoarchitected Tough Biological Composites from Assembled Chitinous Scaffolds (2022)
  • Author(s): Huang Wei、Montroni Devis、Wang Taifeng、Murata Satoshi、Arakaki Atsushi、Nemoto Michiko、Kisailus David
  • Journal Title: Accounts of Chemical Research Volume: 55 Issue: 10 Pages: 1360-1371
  • DOI: 10.1021/acs.accounts.2c00110
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Evaluation of the Geenius HIV 1/2 confirmatory assay for HIV-2 samples isolated in Japan (2022)
  • Author(s): Shigemi Urara、Yamamura Yoshimi、Matsuda Masakazu、Okazaki Reiko、Kubota Mai、Ibe Shiro、Nemoto Michiko、Maejima-Kitagawa Masami、Sukegawa Sayaka、Imahashi Mayumi、Kikuchi Tadashi、Sugiura Wataru、Iwatani Yasumasa、Hachiya Atsuko、Yokomaku Yoshiyuki
  • Journal Title: Journal of Clinical Virology Volume: 152 Pages: 105189-105189
  • DOI: 10.1016/j.jcv.2022.105189
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fibrous anisotropy and mineral gradients within the radula stylus of chiton: Controlled stiffness and damage tolerance in a flexible biological composite (2022)
  • Author(s): Lee Jung-Eun、Connolly John、Yang Wen、Freychet Guillaume、Wang Taifeng、Herrera Steven A、Murata Satoshi、Dasika Phani Saketh、Montroni Devis、Pohl Anna、Zhu Chenhui、Zhernenkov Mikhail、Wuhrer Richard、Sheppard Leigh、Nemoto Michiko、Arakaki Atsushi、Zavattieri Pablo、Kisailus David
  • Journal Title: Journal of Composite Materials Volume: 57 Issue: 4 Pages: 565-574
  • DOI: 10.1177/00219983221121867
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒザラガイにおける鉄濃縮・沈着メカニズムの解析 (2024)
  • Author(s): 根本理子
  • Organizer: 第65回日本植物生理学会年会
  • Invited
• [Presentation] 驚異的な鉄代謝能力を持つヒザラガイの鉄濃縮・沈着メカニズムの解析 (2024)
  • Author(s): 根本理子
  • Organizer: 日本農芸化学会2024年大会創立100周年記念式典
  • Invited
• [Presentation] 海洋性Nitzschia属珪藻NOH-41株のエレクトロポレーション法による形質転換系の確立 (2023)
  • Author(s): 岡田航輝、森本佑、白石幸音、田村隆、角野貴志、足立真佐雄、伊福健太郎、根本理子
  • Organizer: 第23回マリンバイオテクノロジー学会
• [Presentation] ヒザラガイによる鉄濃縮・沈着機構の解析 (2023)
  • Author(s): 根本理子
  • Organizer: 第47回日本鉄バイオサイエンス学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] ヒザラガイRTMP1ホモログの遺伝子ノックダウンが磁鉄鉱歯形成に及ぼす影響の評価 (2023)
  • Author(s): 赤嶺 晴香、金尾 忠芳、田村隆、鈴木 道生、David Kisailus、大越健嗣、根本理子
  • Organizer: 第75回日本生物工学会大会
• [Presentation] 生体鉱物形成に関わるタンパク質に関する研究 (2023)
  • Author(s): 根本理子
  • Organizer: 農芸化学会中四国支部第64回支部講演会
  • Invited
• [Presentation] RNA干渉法を用いたヒザラガイのRTMP1ホモログ遺伝子の 機能解析 (2022)
  • Author(s): 赤嶺晴香
  • Organizer: 第 22 回マリンバイオテクノロジー学会大会
• [Presentation] Identification of proteins involved in chiton tooth biomineralization by RNA-seq-based analyses (2022)
  • Author(s): Michiko Nemoto
  • Organizer: Gordon Research Conference Biomineralization
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Exploration of genes involved in radular teeth formation in chitons by cross-species transcriptome comparison (2022)
  • Author(s): Koki Okada
  • Organizer: Gordon Research Conference Biomineralization
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒザラガイの磁鉄鉱歯形成関連タンパク質の同定 (2022)
  • Author(s): 根本理子
  • Organizer: 第33回日本微量元素学会学術集会
• [Presentation] Exploration of genes involved in magnetite teeth formation in chitons by transcriptome comparison (2022)
  • Author(s): Koki Okada
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒザラガイ歯舌の磁鉄鉱形成関連タンパク質の同定 (2022)
  • Author(s): 根本理子
  • Organizer: 動物学会 岡山県例会企画セミナー
• [Book] 貝の疑問50 (2023)
  • Author(s): 根本理子（分担執筆）
  • Total Pages: 211
  • Publisher: 成山堂書店