蛍光動的消光測定による生細胞内RNA立体構造の情報物理解析

• Project Area: Information physics of living matters
• Project/Area Number: 22H04826
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 北村 朗 北海道大学, 先端生命科学研究院, 講師 (10580152)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: RNA / 蛍光相関分光法 / 熱力学的安定性 / 生細胞イメージング

Outline of Research at the Start

ブリンキングによりジャギーな（理論モデルに対して残差の大きな変化を伴う）自己相関関数に対し，精度の高い非線形フィッティングを行う新規解析手法を確立した上で，立体構造を形成することが知られているRNA配列を選択し，蛍光分子内異性化速度の変化によりRNA立体構造変化を読み取るFCS測定系を樹立する．さらに，生細胞内に導入した蛍光標識RNAのFCS解析により，生細胞内においてRNAは溶液と同様の熱力学的に安定な立体構造を有するかという問題点を解明する．

Outline of Annual Research Achievements

生体分子の一つであるRNAの立体構造を生きた細胞内で測定・解析可能な刑を構築し，分子の構造安定性や構造変化を明らかにするために，RNAの特殊構造としてグアニン四重鎖 (G-quadruplex, 以下Gq)に着目した．この生細胞内立体構造を，RNAに標識したシアニン蛍光色素の光異性化状態の変化（蛍光ブリンキングの速度変化として計測される）を読みだすための新規手法を開発し，この結果は前年度，核酸科学・分子生物学で著名なNucleic Acids Reaserch誌に掲載された．この成果を得る過程で，RNA鎖中に最大二個のGqが形成されうる配列では，5'に標識した蛍光色素の光異性化では検出感度が鈍ることが分かっていた．そこでRNA鎖中に蛍光標識を行い，その光異性化を介して立体構造形成が識別できることを検証した．この解析過程で，自己相関関数の非線形カーブフィッティングの精度を高める検討を行った．その結果，多成分解析の精度の向上には更なる統計的推定法の利用が必要なことが分かったが，分子数の推定精度を上げることに成功した．分子数精度の向上はブリンキング状態の推定精度向上につながることから，重要な検証内容であると言える．以上の構築系を利用し解析することで，試験管の中では温度を上昇させて変性させたのち，温度低下させて形成されるGq構造が，生細胞内では温度上昇を伴わずに形成されていることが示唆された．
また，緑色蛍光タンパク質GFPが粘性に応答して蛍光寿命が短くなることにより，細胞内クラウディングの情報物理的指標になることを発見した報告を投稿中であったが，Scientific Reports誌に受理された．

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] カロリンスカ研究所(スウェーデン)
• [Int'l Joint Research] 王立工科大学(スウェーデン)
• [Int'l Joint Research] カロリンスカ研究所(スウェーデン)
• [Int'l Joint Research] ノースウェスタン大学(米国)
• [Journal Article] Stress granule dysfunction via chromophore-associated light inactivation (2023)
  • Author(s): Koizumi Takumi、Fujimoto Ai、Kawaguchi Haruka、Kurosaki Tsumugi、Kitamura Akira
  • Journal Title: bioRxiv Volume: -
  • DOI: 10.1101/2023.08.12.553066
  • Open Access
• [Journal Article] Axonal transport of Frizzled5 by Alcadein α-containing vesicles is associated with kinesin-1 (2023)
  • Author(s): Shiraki Yuzuha、Mitsuma Monet、Takada Ritsuko、Hata Saori、Kitamura Akira、Takada Shinji、Kinjo Masataka、Taru Hidenori、M?ller Ulrike C.、Yamamoto Tohru、Sobu Yuriko、Suzuki Toshiharu
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 34 Issue: 11
  • DOI: 10.1091/mbc.e22-10-0495
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Increased intracellular crowding during hyperosmotic stress (2023)
  • Author(s): Kitamura Akira、Oasa Sho、Kawaguchi Haruka、Osaka Misato、Vukojevic Vladana、Kinjo Masataka
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 13 Issue: 1 Pages: 11834-11834
  • DOI: 10.1038/s41598-023-39090-w
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Light-Induced Condensates Show Accumulation-Prone and Less Dynamic Properties in the Nucleus Compared to the Cytoplasm (2023)
  • Author(s): Hamada Yuta、Kitamura Akira
  • Journal Title: Spectroscopy Journal Volume: 1 Issue: 2 Pages: 65-71
  • DOI: 10.3390/spectroscj1020006
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Trans-cis isomerization kinetics of cyanine dyes reports on the folding states of exogeneous RNA G-quadruplexes in live cells (2023)
  • Author(s): Kitamura Akira、Tornmalm Johan、Demirbay Baris、Piguet Joachim、Kinjo Masataka、Widengren Jerker
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 51 Issue: 5 Pages: e27-e27
  • DOI: 10.1093/nar/gkac1255
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Intracellular Conformation of Amyotrophic Lateral Sclerosis-Causative TDP-43 (2023)
  • Author(s): Kitamura Akira、Yuno Sachiko、Kawamura Rintaro、Kinjo Masataka
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 24 Issue: 6 Pages: 5513-5513
  • DOI: 10.3390/ijms24065513
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] TDP-43タンパク質凝集形成過程におけるシャペロンRNAの役割 (2023)
  • Author(s): 北村朗，藤本愛
  • Journal Title: Bio Clinica Volume: 38 Pages: 56-59
• [Journal Article] Hetero-oligomerization of TDP-43 carboxy-terminal fragments with cellular proteins contributes to proteotoxicity (2022)
  • Author(s): Kitamura Akira、Fujimoto Ai、Kawashima Rei、Lyu Yidan、Moriya Kanami、Kurata Ayumi、Takahashi Kazuho、Brielmann Renee、Bott Laura C.、Morimoto Richard I.、Kinjo Masataka
  • Journal Title: bioRxiv (preprint) Volume: -
  • DOI: 10.1101/2022.05.22.493003
  • Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Short repeat RNA reduces cytotoxicity by preventing the aggregation of TDP-43 and its 25 kDa carboxy-terminal fragment (2022)
  • Author(s): Fujimoto Ai、Kinjo Masataka、Kitamura Akira
  • Journal Title: bioRxiv (preprint) Volume: -
  • DOI: 10.1101/2022.07.03.498631
  • Open Access
• [Journal Article] Increased intracellular crowding during hyperosmotic stress (2022)
  • Author(s): Kitamura Akira、Oasa Sho、Kawaguchi Haruka、Osaka Misato、Vukojevic Vladana、Kinjo Masataka
  • Journal Title: bioRxiv (preprint) Volume: - Pages: 11834-11834
  • DOI: 10.1101/2022.12.30.522363
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Physico- and chemical biology using nanomanipulation and micromanipulation technologies (2022)
  • Author(s): Akira Kitamura, Ryo Iizuka
  • Journal Title: Biophysics and Physicobiology Volume: 19 Issue: 0 Pages: n/a
  • DOI: 10.2142/biophysico.bppb-v19.0044
  • ISSN: 2189-4779
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ALSとFTD関連TDP-43タンパク質凝集形成過程におけるRNAの役割 (2022)
  • Author(s): 北村朗，藤本愛
  • Journal Title: 月刊「細胞」 Volume: 54 Pages: 474-477
• [Presentation] 空間画像相関分光法を用いた粒子数の定量法確立～細胞内液滴または凝集体“数”の迅速定量に向けて～ (2024)
  • Author(s): 濱田 悠太，北村 朗
  • Organizer: 第15回 光塾
• [Presentation] 画像相関分光法 (ICS) による「数」の測定法確立 (2024)
  • Author(s): 濱田 悠太，北村 朗
  • Organizer: 第18回 北大細胞生物研究集会
• [Presentation] 空間画像相関分光法 (SICS) を用いた粒子数測定手法の確立 (2024)
  • Author(s): 濱田 悠太，北村 朗
  • Organizer: 2023年度 日本生物物理学会北海道支部・東北支部合同例会
• [Presentation] short repeat RNAはTDP43の凝集を抑制する (2024)
  • Author(s): 藤本 愛，北村 朗
  • Organizer: 第15回 光塾
• [Presentation] 光技術を駆使した生体分子の会合誘導，動態解析，不活化による分子細胞生物学 (2023)
  • Author(s): 北村 朗
  • Organizer: 第46回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 細胞内区画における天然変性領域を含む光誘起凝縮体の性質 (2023)
  • Author(s): 濱田 悠太，北村 朗
  • Organizer: 第32回 日本バイオイメージング学会
• [Presentation] 光誘起TDP-43 IDR凝縮体の特徴的な脱会合過程 (2023)
  • Author(s): 濱田 悠太，北村 朗
  • Organizer: 第61回 日本生物物理学会年会
• [Presentation] Short repeat RNA that inhibits aggregation of TDP43 and its carboxy-terminal fragment TDP25 (2023)
  • Author(s): 藤本 愛，北村 朗
  • Organizer: 第46回 日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] Intracellular crowding during hyperosmotic stress (2023)
  • Author(s): Akira Kitamura, Sho Oasa, Vladana Vukojevic, Masataka Kinjo
  • Organizer: 第14回光塾
• [Presentation] TDP43の凝集体を抑制できるRNA (2023)
  • Author(s): 藤本愛，金城政孝，北村朗
  • Organizer: 第14回光塾
• [Presentation] 光誘起多量体形成システムを用いた天然変性タンパク質の凝集体形成過程解明 (2023)
  • Author(s): 濱田悠太, 金城政孝, 北村朗
  • Organizer: 第14回光塾
• [Presentation] 筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因タンパク質TDP43に対するシャペロンRNAの基質認識機構と細胞毒性低減効果 (2023)
  • Author(s): 藤本愛，金城政孝，北村朗
  • Organizer: 令和４年度北大細胞生物研究集会
• [Presentation] 筋萎縮性側索硬化症の原因タンパク質 TDP43 凝集体を防ぐシャペロン RNA (2023)
  • Author(s): 藤本愛，金城政孝，北村朗
  • Organizer: 2022年度生物物理学会北海道支部・東北支部合同例会
• [Presentation] RNA構造変化を蛍光ブリンキングで検出する (2022)
  • Author(s): 北村朗
  • Organizer: 第45回 日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] 筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因タンパク質TDP43の凝集を抑制するシャペロンRNAの基質認識機構と細胞毒性低減効果 (2022)
  • Author(s): 藤本愛，金城政孝，北村朗
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Basics and applications of chromophore-assisted light inactivation (CALI) (2022)
  • Author(s): 北村朗
  • Organizer: 第60回 日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] GGGGCC-RNA chaperones to inhibit aggregation of TDP43 and its carboxy fragments (2022)
  • Author(s): 藤本愛，金城政孝，北村朗
  • Organizer: 第60回 日本生物物理学会年会
• [Presentation] Size determination of cytoplasmic condensates of optineurin using spatial image correlation spectroscopy (SICS) (2022)
  • Author(s): 濱田悠太, 金城政孝, 北村朗
  • Organizer: 第60回 日本生物物理学会年会
• [Presentation] The E50K mutation of optineurin increases the oligomer size（Optineurinの緑内障変異はオリゴマー粒形を増大させる） (2022)
  • Author(s): 河村綸太郎，植月聡也，丹澤豪人，加藤貴之，金城政孝，北村朗
  • Organizer: 第60回 日本生物物理学会年会
• [Presentation] Intracellular structure and function of chaperone RNA (2022)
  • Author(s): Akira Kitamura
  • Organizer: International Workshop on Fluorescence Methods and Applications 2022
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Elucidation of the phase separation process of intrinsically disordered protein using an optogenetic oligomerization tag (2022)
  • Author(s): Yuta Hamada, Masataka Kinjo, Akira Kitamura
  • Organizer: 8th International Life Science Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 高速な細胞内分子クラウディングセンサーの開発に成功
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/news/2023/07/post-1272.html
• [Remarks] researchmap
  • URL: https://researchmap.jp/akitamuratora
• [Remarks] researchgate
  • URL: https://www.researchgate.net/profile/Akira-Kitamura
• [Remarks] プレスリリース 蛍光明滅を利用したRNA立体構造検出に成功
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/news/2023/01/rnarna.html
• [Patent(Industrial Property Rights)] ＴＤＰ４３、ＴＤＰ３５、またはＴＤＰ２５の凝集を特徴とする神経変性疾患の治療剤、進行抑制剤、および予防剤 (2022)
  • Inventor(s): 北村朗，藤本愛
  • Industrial Property Rights Holder: 北村朗，藤本愛
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2022