Creation of digitally designed artificial metalloenzyme catalyzing desirable C-H functionalization by

• Project Area: Digitalization-driven Transformative Organic Synthesis (Digi-TOS)
• Project/Area Number: 22H05364
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (II)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大洞 光司 大阪大学, 大学院工学研究科, 准教授 (10631202)
• Project Period (FY): 2022-06-16 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000); Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2022: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
• Keywords: 人工酵素 / 触媒 / 物質変換

Outline of Research at the Start

本研究では、自在物質変換反応の実現をめざして、高活性な金属錯体とタンパク質マトリクスを組み合わせ、高活性かつ高選択性を達成する人工金属酵素を開発する。 具体的には、生体内で難易度の高いC-H結合水酸化反応を触媒する天然金属酵素(シトクロムP450)の反応性を参考に、C-H結合官能基化反応に高い触媒能を示す活性中心となる金属錯体と機械学習により設計したタンパク質マトリクスを組み合わせた人工金属酵素を調製し、評価する。高活性で、高い立体・位置選択性、さらには反応性を凌駕する官能基選択性を示す触媒系の自在設計法を開拓する。

Outline of Annual Research Achievements

持続可能社会の実現に向けて、環境調和型かつ貴金属を含まない触媒を用いた物資変換反応が注目されている。この条件は酵素と類似しているが、その一方で天然酵素の多くは基質適用範囲が狭く、有機合成への利用は限られている。本研究では、自在物質変換反応の実現をめざして、高活性な金属錯体とタンパク質マトリクスを組み合わせ、高活性かつ高選択的を達成する人工金属酵素の開発およびその設計法の確立を目的としている。本年度は前年度に探索した金属錯体とタンパク質マトリクスの組み合わせから、活性の高かったシトクロムP450あるいはミオグロビンと鉄ポルフィセンの組み合わせを選択した。特にC-H結合のアミノ化反応に注力して調査した。ミオグロビンの変異体では、三級のC-H結合に対し、最大数千の触媒回転数を示し、有効な人工金属酵素であることを確認した。シトクロムP450に関しては軸配位子を網羅的に変異導入し、その中からアスパラギン酸を軸配位子とする変異体が高い活性を示すことを確認した。シトクロムP450では二級のC-H結合のアミノ化を試みた。複数の変異点から有力な箇所を選定し、網羅的に一重変異体を作成し、それらの触媒活性、立体選択性を調べた。これらのデータと配列のみのデータから機械学習を実施し、多重変異体の予測を実施した。最終的に10倍を超える活性を示す変異体を発見した。また機械学習が変異体探索を加速させることを確認した。今後はより一般化した設計手法に展開することで、様々な反応に有用な人工金属酵素の開発に貢献すると期待される。これらの成果の一部は国際学術誌に学術論文として発表し、また学会等でも発表を行ない、高い評価を得た。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] RWTH Aachen(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] University of Groningen(オランダ)
• [Journal Article] Intramolecular C-H bond amination catalyzed by myoglobin reconstituted with iron porphycene (2024)
  • Author(s): Kagawa Yoshiyuki、Oohora Koji、Hayashi Takashi
  • Journal Title: Journal of Inorganic Biochemistry Volume: 252 Pages: 112459-112459
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2023.112459
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ethylbenzene oxidation by a hybrid catalysis system of reconstituted myoglobin and silica-protected PdAu nanoparticles under a hydrogen-oxygen mixed atmosphere (2023)
  • Author(s): Oohora Koji、Kagawa Yoshiyuki、Kuwahara Yasutaka、Yamashita Hiromi、Hayashi Takashi
  • Journal Title: Journal of Porphyrins and Phthalocyanines Volume: 27 Issue: 07n10 Pages: 1313-1319
  • DOI: 10.1142/s1088424623500906
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rational design of an artificial ethylbenzene hydroxylase using a molecular dynamics simulation to enhance enantioselectivity (2023)
  • Author(s): Oohora Koji、Kagawa Yoshiyuki、Nishiura Takako、Mizohata Eiichi、Schwaneberg Ulrich、Hayashi Takashi
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 53 Issue: 2
  • DOI: 10.1093/chemle/upad042
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Disulfide Bond-mediated Oligomerization of a Green Fluorescent Protein in Solution (2023)
  • Author(s): Soon Julian Wong、Oohora Koji、Uchihashi Takayuki、Hayashi Takashi
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 52 Issue: 2 Pages: 105-109
  • DOI: 10.1246/cl.220495
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A disulphide bond-mediated hetero-dimer of a hemoprotein and a fluorescent protein exhibiting efficient energy transfer (2022)
  • Author(s): Soon Julian Wong、Oohora Koji、Hayashi Takashi
  • Journal Title: RSC Advances Volume: 12 Issue: 44 Pages: 28519-28524
  • DOI: 10.1039/d2ra05249k
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Hemoprotein Assembly Containing Porphyrinoid Photosensitizers Toward an Artificial Light- Harvesting System (2023)
  • Author(s): Koji Oohora
  • Organizer: 15th International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors in Photosynthetic Organisms
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 鉄ポルフィセン錯体を含む再構成ヘムタンパク質によるC-H結合アミノ化触媒反応 (2023)
  • Author(s): 大洞 光司、香川佳之、林 高史
  • Organizer: 第56回酸化反応討論会
• [Presentation] Catalytic C-H bond amination by engineered hemoproteins containing iron porphycene as an artificial cofactor (2023)
  • Author(s): 香川佳之、大洞光司、林 高史
  • Organizer: 日本化学会 第103春季年会
• [Presentation] ヘムタンパク質の補因子置換による人工金属酵素の開発 (2023)
  • Author(s): 大洞光司、林 高史
  • Organizer: 日本薬学会 第143年会
  • Invited
• [Presentation] Construction of Stimuli-responsive Materials Containing a Metalloporphyrin- Peptide Conjugate as a Building Block (2022)
  • Author(s): Koji Oohora, Takashi Hayashi
  • Organizer: International Conference on Metal-Binding Peptides: Methodologies and Applications
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Reconstituted Myoglobin with Corrole Metal Complexes and its Reactivity toward Hydrogen Peroxide (2022)
  • Author(s): Koji Oohora, Takashi Hayashi
  • Organizer: Twelfths International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 鉄ポルフィセン錯体を補因子として有するヘムタンパク質を用いたC-H結合アミノ化反応 (2022)
  • Author(s): 香川佳之、大洞光司、林 高史
  • Organizer: 第16回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] Catalytic C-H bond amination by hemoproteins reconstituted with iron porphycene (2022)
  • Author(s): Yoshiyuki Kagawa, Koji Oohora, Takashi Hayashi
  • Organizer: Active Enzyme Molecule 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Hydrogen Peroxide-dependent Catalytic C-H Bond Hydroxylation by Hemoprotein Reconstituted with Mn Porphyrcene (2022)
  • Author(s): Koji Oohora, Takashi Hayashi
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Catalytic amination of C-H bond by hemoproteins reconstituted with iron porphycene (2022)
  • Author(s): Yoshiyuki Kagawa, Koji Oohora, Takashi Hayashi
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • Int'l Joint Research
• [Remarks]
  • URL: http://www.applied-bioinorganic.jp/jp/profile/oohora/
• [Remarks] 大阪大学大学院工学研究科応用化学専攻林研究室
  • URL: http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~hayashiken/index.html