Development of the cell-free synthesis system of membrane proteins for integration into society

• Project Area: Bottom-up creation of cell-free molecular systems: surpassing nature
• Project/Area Number: 22H05392
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (II)
• Research Institution: Iwate University
• Principal Investigator: 西山 賢一 岩手大学, 農学部, 教授 (80291334)
• Project Period (FY): 2022-06-16 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000); Fiscal Year 2023: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2022: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
• Keywords: タンパク質膜挿入 / 再構成 / 試験管内タンパク質合成 / MPIase / 膜保護活性 / 膜タンパク質 / リポソーム / 創薬 / 糖脂質 / タンパク質膜透過

Outline of Research at the Start

膜タンパク質は多くの生命活動のプログラムに必須の役割を果たしているうえ、市販の薬剤の半数以上は膜タンパク質を標的にしたものである。そのため、汎用的セル・フリー膜タンパク質合成システムが開発できれば、膜タンパク質の構造や機能に関する理解が進み、新規薬剤開発も容易になる。本研究では、社会実装可能で汎用的な膜挿入システムの構築を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

申請者らはモデル生物大腸菌におけるタンパク質膜挿入機構を解析し、糖脂質MPIaseを同定し、構造・機能解析を進めてきた。SecYEGやSRP、YidCなど、従来タンパク質膜挿入に関与することが知られている因子とMPIaseを組み合わせて、タンパク質膜挿入の再構成系の構築に成功した。再構成リポソームはマグネシウムなどの化学物質に対して不安定であることに着想を得て、生体膜に耐性度を与える物質、BPFの精製を進めてきた。前年度までの解析により、BPFはMPIaseに類似の化合物であることがわかっていた。本年度はBPFの構造をより詳細に解析したところ、BPFとMPIaseは同一の構造であることが判明した。したがって、MPIaseとタンパク質性の膜挿入因子を組み合わせることにより汎用的な膜タンパク質合成・膜挿入システムの構築ができると期待される。MPIaseは微量糖脂質であるため、MPIaseの部分化学合成標品を用いて本システムの構築を目指した。MPIaseはアセチル化された３種のアミノ糖からなる糖ユニットが１０回程度繰り返した糖鎖をもつ。繰り返し数が１のmini-MPIaseでも膜挿入活性が発現し、繰り返し数が２、３と増加するにつれ膜挿入活性が上昇した。３糖ユニットを構成するGlcNAcの６位は一部O-アセチル化されている。O-アセチル基を有するmini-MPIaseでは強い膜挿入活性が検出されたが、O-アセチル基をもたないmini-MPIaseではほとんど膜挿入活性が観察されなかった。一方、O-アセチル基をもたないmini-MPIaseは強い膜保護活性を示し、O-アセチル基をもつmini-MPIaseの膜保護活性は弱かった。O-アセチル基をもつmini-MPIaseとO-アセチル基をもたないmini-MPIaseを共存させることにより汎用的な膜挿入システムの構築が可能になる。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] CdsA, a CDP‐diacylglycerol synthase involved in phospholipid and glycolipid MPIase biosynthesis, possesses multiple initiation codons (2024)
  • Author(s): Hikage Runa、Sekiya Yusei、Sawasato Katsuhiro、Nishiyama Ken‐ichi
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 29 Issue: 4 Pages: 347-355
  • DOI: 10.1111/gtc.13104
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural Requirements of a Glycolipid MPIase for Membrane Protein Integration (2023)
  • Author(s): Kohki Fujikawa, Youjung Han, Tsukiho Osawa, Shoko Mori, Kaoru Nomura, Maki Muramoto, Ken-ichi Nishiyama, Keiko Shimamoto
  • Journal Title: Chemistry A European Journal Volume: - Issue: 30
  • DOI: 10.1002/chem.202300437
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Coordinated upregulation of two CDP-diacylglycerol synthases, YnbB and CdsA, is essential for cell growth and membrane protein export in the cold (2023)
  • Author(s): Kamemoto Yuki、Hikage Runa、Han Youjung、Sekiya Yusei、Sawasato Katsuhiro、Nishiyama Ken-ichi
  • Journal Title: FEMS Microbiology Letters Volume: 370
  • DOI: 10.1093/femsle/fnad131
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Intermolecular Interactions between a Membrane Protein and a Glycolipid Essential for Membrane Protein Integration (2022)
  • Author(s): Mori Shoko、Nomura Kaoru、Fujikawa Kohki、Osawa Tsukiho、Shionyu Masafumi、Yoda Takao、Shirai Tsuyoshi、Tsuda Shugo、Yoshizawa-Kumagaye Kumiko、Masuda Shun、Nishio Hideki、Yoshiya Taku、Suzuki Sonomi、Muramoto Maki、Nishiyama Ken-ichi、Shimamoto Keiko
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 17 Issue: 3 Pages: 609-618
  • DOI: 10.1021/acschembio.1c00882
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Role of a bacterial glycolipid in Sec-independent membrane protein insertion (2022)
  • Author(s): Nomura K, Mori S, Fujikawa K, Osawa T, Tsuda S, Yoshizawa-Kumagaye K, Masuda S, Nishio H, Yoshiya T, Yoda T, Shionyu M, Shirai T, Nishiyama KI, Shimamoto K.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 12 Issue: 1 Pages: 12231-12231
  • DOI: 10.1038/s41598-022-16304-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Interaction between glycolipid MPIase and proteinaceous factors during protein integration into the cytoplasmic membrane of E. coli (2022)
  • Author(s): Nishikawa Hanako、Sawasato Katsuhiro、Mori Shoko、Fujikawa Kohki、Nomura Kaoru、Shimamoto Keiko、Nishiyama Ken-Ichi
  • Journal Title: Frontiers in Molecular Biosciences Volume: 9 Pages: 986602-986602
  • DOI: 10.3389/fmolb.2022.986602
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A bacterial glycolipid essential for membrane protein integration (2022)
  • Author(s): Fujikawa Kohki、Mori Shoko、Nishiyama Ken-ichi、Shimamoto Keiko
  • Journal Title: Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry Volume: 81 Pages: 95-129
  • DOI: 10.1016/bs.accb.2022.09.005
  • ISBN: 9780323985888
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 低温かつ CdsA の制限された条件における YnbB の重要性 (2024)
  • Author(s): 日景瑠那、西山賢一
  • Organizer: 第4回細胞形成研究会
• [Presentation] タンパク質膜挿入に関わる糖脂質酵素MPIaseの構造と機能に関する研究 (2024)
  • Author(s): Han Youjung、西山賢一
  • Organizer: 第4回細胞形成研究会
• [Presentation] 大腸菌内膜、外膜由来の生体膜保護物質の同定と構造・機能解析 (2024)
  • Author(s): 古谷萩、西山賢一
  • Organizer: 第4回細胞形成研究会
• [Presentation] 生体膜保護物質（BPF）の同定・構造機能解析～BBMV由来のマウスBPF精製スキームの検討～ (2024)
  • Author(s): 渡会未夢、古谷萩、Wiriyasermukul Pattama、永森收志、西山賢一
  • Organizer: 第4回細胞形成研究会
• [Presentation] TATタンパク質膜透過機構の解析 (2024)
  • Author(s): 西川華子、西山賢一
  • Organizer: 第4回細胞形成研究会
• [Presentation] YidCと相互作用する機能未知因子YibNのin vitro 解析 (2024)
  • Author(s): 山本波知、西川華子、Katherine Zhao、Franck Duong、西山賢一
  • Organizer: 第4回細胞形成研究会
• [Presentation] 大腸菌生体膜由来の膜保護物質の同定および構造機能解析 (2024)
  • Author(s): 古谷 萩、沢里克宏、森祥子、藤川紘樹、島本啓子、西山賢一
  • Organizer: 第9回デザイン生命工学研究会
• [Presentation] 再構成系を用いたTAT 膜透過機構の解析 (2024)
  • Author(s): 西川 華子、山本 波知、菅野 琴華、沢里 克宏、山田 美和、西山 賢一
  • Organizer: 第18 回 無細胞生命科学研究会
• [Presentation] 大腸菌EmrE タンパク質の膜挿入機構の解析 (2024)
  • Author(s): 山本 波知、小川 裕太、西川 華子、松浦 友亮、西山 賢一
  • Organizer: 第18 回 無細胞生命科学研究会
• [Presentation] リン脂質および糖脂質MPIase 生合成に関わるCDP-ジアシルグリセロール生合成酵素をコードするcdsA遺伝子の翻訳開始領域の解析 (2024)
  • Author(s): 日景瑠那 、関谷優晟 、沢里克宏 、西山賢一
  • Organizer: 日本農芸化学会 2024年度大会
• [Presentation] CDP-ジアシルグリセロール生合成酵素CdsAの翻訳開始領域の解析 (2023)
  • Author(s): 日景瑠那、西山賢一
  • Organizer: 第19回 21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 大腸菌のタンパク質膜挿入に関わる糖脂質MPIaseの生合成酵素の探索 (2023)
  • Author(s): 澁谷まゆ、Han Youjung、田近優太、大澤月穂、藤川絋樹、島本啓子、西山賢一
  • Organizer: 予知生合成科学 第２回公開シンポジウム
• [Presentation] 構造類似糖脂質MPIase、BPF、ECAの生合成酵素の探索・比較による糖付加戦略の解明 (2023)
  • Author(s): 西山賢一
  • Organizer: 予知生合成科学 第２回公開シンポジウム
• [Presentation] 社会実装を目指した汎用的セル・フリー膜タンパク質合成システムの開発 (2023)
  • Author(s): 西山賢一
  • Organizer: 超越分子システム 第二回領域会議
• [Presentation] 膜タンパク質の複合体形成と機能発現におけるMPIaseの役割 (2023)
  • Author(s): 山本波知、西川華子、Pattama Wiryasermkul、永森収志、西山賢一
  • Organizer: 超越分子システム 第二回領域会議
• [Presentation] TAT （Twin-Arginine Translocation ）膜透過機構の解析 (2023)
  • Author(s): 西川華子、山本波知、菅野琴華、沢里克宏、山田美和、西山賢一
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] タンパク質膜挿挿入に関与するMPIase生合成酵素の探索 (2023)
  • Author(s): Han Youjung、藤川 紘樹、島本啓子、西山賢一
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
• [Presentation] ヒト細胞を用いた真核生物のタンパク質膜挿入因子 MPIaseホモログの探索 (2023)
  • Author(s): 日景 瑠那、Wiriyasemkul Pattama、永森收志、西山賢一
  • Organizer: 第8回 デザイン生命工学研究会
• [Presentation] 大腸菌生体膜由来の生体膜保護物質の同定とその構造機能解析 (2022)
  • Author(s): 古谷萩、沢里克宏、森祥子、藤川絋樹、島本啓子、西山賢一
  • Organizer: 21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 社会実装を目指した汎用的セル・フリー膜タンパク質合成システムの開発 (2022)
  • Author(s): 西山 賢一
  • Organizer: 「生物を凌駕する無細胞分子システムのボトムアップ構築学」第2回領域会議
• [Presentation] MPIase生合成酵素の探索 (2022)
  • Author(s): 澁谷まゆ、Han Youjung、大澤月穂、藤川紘樹、島本啓子、西山賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] 大腸菌生体膜由来の膜保護物質の同定と構造機能解析 (2022)
  • Author(s): 古谷萩、沢里克宏、森祥子、藤川絋樹、島本啓子、西山賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] 生体膜保護物質（BPF）の同定・構造機能解析 (2022)
  • Author(s): 渡会未夢、古谷萩、Wiriyasemkul Pattama、永森收志、西山賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] 膜タンパク質の膜挿入と複合体形成におけるMPIase の機能 (2022)
  • Author(s): 山本波知、西川華子、西山賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] タンパク質の膜挿入反応を触媒する糖脂質MPIaseの構造・機能解析 (2022)
  • Author(s): Han Youjung、藤川 紘樹、大澤 月穂、村本 真規、島本 啓子、西山 賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] 膜挿入基質タンパク質GFP-Tom5の精製 (2022)
  • Author(s): 木村 樹南、森 祥子、藤川 紘樹、島本 啓子、西山 賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] 真核生物のMPIase（Membrane protein integrase）ホモログの探索 (2022)
  • Author(s): 日景 瑠那、Wiriyasemkul Pattama 、永森收志、西山賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] TAT（Twin-Arginine Translocation ）膜透過反応の分子機構解析 (2022)
  • Author(s): 西川華子、西山賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
• [Presentation] 膜タンパク質のバイオジェネシスに関与する糖脂質MPIaseの構造と機能 (2022)
  • Author(s): 西山賢一
  • Organizer: 第3回細胞形成研究会
  • Invited
• [Presentation] タンパク質の膜挿入反応を触媒する糖脂質MPIaseの構造・機能解析 (2022)
  • Author(s): Han Youjung、藤川 紘樹、大澤 月穂、村本 真規、島本 啓子、西山 賢一
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
• [Remarks] 岩手大学農学部・応用生物化学科・分子生物学研究室
  • URL: http://news7a1.atm.iwate-u.ac.jp/~sec/