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局所光操作と蛍光寿命イメージングによるシナプス内メゾスケール組織化機構の解明

Publicly Offered Research

Project AreaNew cross-scale biology
Project/Area Number 22H05549
Research Category

Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Transformative Research Areas, Section (III)
Research InstitutionNational Institute for Physiological Sciences

Principal Investigator

村越 秀治  生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 准教授 (90608142)

Project Period (FY) 2022-06-16 – 2024-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Keywords2光子蛍光寿命イメージング / シナプス / 光操作 / 蛍光寿命イメージング
Outline of Research at the Start

本研究ではCdc42の活性化因子(GEF)に着目し、CaMKII-Cdc42活性変換メカニズムを明らかにする。Cdc42の活性化因子(GEF)の候補は70種類程度あり、研究対象とするには膨大である。しかしながら最近、GEFの特異性の網羅的解析や発現量のデータベースを活用することで候補分子を70種類から6種類にまで絞り込むことができた。そこで本研究では、これら6種類のGEF分子に着目し、我々が独自開発した光応答性分子による局所光操作技術や2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡で定量解析する。

Outline of Annual Research Achievements

Cdc42はスパイン内での光応答性CaMKII活性化により活性化される(Shibata et al. 2021)。すなわち、光応答性CaMKII活性化に応じてスパインにリクルートされるCdc42の活性化因子(80種類のGEF)の中から分子を同定すれば、それがCdc42を活性化させる変換因子である可能性がある。そこで、2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡法(2pFLIM)を用いて各分子がスパインにリクルートされるかどうかをサブスパインの空間分解能でしかも定量的に調べることにした。具体的には、各候補分子を短い蛍光寿命(0.82ナノ秒)をもつ蛍光タンパク質BrUSLEEでタグ付けした。このプローブを、長い蛍光寿命(2.6ナノ秒)をもつEGFPと海馬神経細胞に共発現させた。そして、1000 nmの2光子励起で2pFLIMを行いながら、720 nmの2光子励起でケイジドグルタミン酸でLTPを誘起した。この方法を用いた予備的な結果として、研究代表者は候補分子の中から、LTP依存的にスパインにリクルートされる分子のイメージングに成功した。また現在までに、CaMKIIの下流分子の探索を進めており、DNAマイクロアレイによる発現解析やCaMKII下流のRhoGEFの解析を進めている。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • Research Products

    (8 results)

All 2023 2022

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 5 results)

  • [Journal Article] Imaging single CaMKII holoenzymes at work by high-speed atomic force microscopy.2023

    • Author(s)
      Tsujioka S, Sumino A, Nagasawa Y, Sumikama T, Flechsig H, Puppulin L, Tomita T, Baba Y, Kakuta T, Ogoshi T, Umeda K, Kodera N, Murakoshi H, Shibata M.
    • Journal Title

      Science Advances

      Volume: 9(26)

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] LOV2-based photoactivatable CaMKII and its application to single synapses: Local Optogenetics2023

    • Author(s)
      Yutaro Nagasawa; Hiromi H. Ueda; Haruka Kawabata; Hideji Murakoshi
    • Journal Title

      Biophysics and Physicobiology

      Volume: 20 Issue: 2 Pages: n/a

    • DOI

      10.2142/biophysico.bppb-v20.0027

    • ISSN
      2189-4779
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] In-vivo three- and four-photon fluorescence microscopy using a 1.8 μm femtosecond fiber laser system.2022

    • Author(s)
      Murakoshi H, Ueda HH, Goto R, Hamada K, Nagasawa Y, and Fuji T.
    • Journal Title

      Biomedical Optics Express

      Volume: 14 Issue: 1 Pages: 326334-326334

    • DOI

      10.1364/boe.477322

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Understanding the Meso-scale organization by single synaptic optical manipulation.2023

    • Author(s)
      村越秀治
    • Organizer
      蛋白質学会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] シナプス内“短時間-長時間”変換シグナル機構2023

    • Author(s)
      村越秀治
    • Organizer
      神経病理・神経化学合同大会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] シグナル分子の活性化観察と操作によるシナプス可塑性機構の解明2023

    • Author(s)
      村越秀治
    • Organizer
      大阪大学蛋白質研究所セミナー
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Optogenetic manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines of neurons.2023

    • Author(s)
      Hideji Murakoshi
    • Organizer
      IINS - NIPS joint symposium
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Optogenetic manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines of neurons2022

    • Author(s)
      村越秀治
    • Organizer
      NEURO2022
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited

URL: 

Published: 2022-06-20   Modified: 2024-12-25  

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