液－液相分離を制御する非ドメイン型タンパク質の探索と単分子機能解析

• Project Area: Biology of Non-domain Biopolymer
• Project/Area Number: 22H05582
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 鎌形 清人 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (90432492)
• Project Period (FY): 2022-06-16 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000); Fiscal Year 2023: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2022: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: 液液相分離 / 非ドメイン型タンパク質 / 予測 / 光ピンセット / 液-液相分離 / 相分離制御タンパク質の予測 / 単分子蛍光顕微鏡 / 光ピンセット顕微鏡 / 分子動力学シミュレーション

Outline of Research at the Start

細胞中には、液－液相分離によって生じる膜のない小器官が存在する。細胞内に含まれる分子Xによって膜のない小器官は制御されていると考えられる。本研究では、アミノ酸ペアの結合エネルギーの計算法を用いて、機能未知の非ドメイン型タンパク質の中から、液－液相分離するタンパク質に結合し、この液－液相分離状態の形成を制御するものを予測し見つけ出す。続いて、光ピンセット顕微鏡、単分子蛍光顕微鏡、分子動力学シミュレーションを組み合わせ、この液－液相分離の促進・消失のメカニズムを解明する。

Outline of Annual Research Achievements

細胞中には、液－液相分離によって生じる膜のない小器官が存在する。細胞内に含まれる分子Xによって膜のない小器官は制御されていると考えられる。本研究では、アミノ酸ペアの結合エネルギーの計算法を用いて、機能未知の非ドメイン型タンパク質の中から、液－液相分離するタンパク質に結合し、この液－液相分離状態の形成を制御するものを予測し見つけ出すことを目的とした。また、光ピンセット顕微鏡、単分子蛍光顕微鏡、分子動力学シミュレーションを組み合わせ、この液－液相分離の促進・消失のメカニズムの解明を目的とした。
当該年度は、まず、アミノ酸ペアの結合エネルギーの計算法の精度を向上させ、液－液相分離状態に取り込まれるタンパク質の実験データを再現できることを確認した。続いて、機能未知の非ドメイン型タンパク質の中から、液－液相分離するタンパク質に結合するものを探索するプログラムを作成した。
次に、開発した光ピンセット顕微鏡による相分離状態の力学計測を行った。まず、相分離タンパク質を大腸菌で発現し、液体クロマトグラフィーで精製した。次に、相分離タンパク質に直鎖状高分子PEGを介してビーズに連結した。続いて、昨年度開発した光ピンセット顕微鏡を用いて、相分離状態内でビーズに連結したタンパク質分子を一方向に引っ張りながら、分子にかかる力を計測した。
続いて、単分子蛍光顕微鏡を用いて、相分離状態内での相分離タンパク質や様々なタンパク質（非ドメイン型タンパク質を含む）の動きを計測した。斜光照明と呼ばれるシート状の照明を用いて、単分子レベルでの計測を行った。相分離タンパク質間の結合力と分子の動きの結果を統合し、その関連性を考察した。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] フランス国立科学研究センター(フランス)
• [Journal Article] Molecular principles of recruitment and dynamics of guest proteins in liquid droplets of p53 and FUS (2023)
  • Author(s): 鎌形 清人
  • Journal Title: 生化学 Volume: 95 Issue: 3 Pages: 330-335
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2023.950330
  • ISSN: 0037-1017
  • Year and Date: 2023-06-25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-molecule characterization of target search dynamics of DNA-binding proteins in DNA-condensed droplets (2023)
  • Author(s): Kamagata Kiyoto、Kusano Ryo、Kanbayashi Saori、Banerjee Trishit、Takahashi Hiroto
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 51 Issue: 13 Pages: 6654-6667
  • DOI: 10.1093/nar/gkad471
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Suppression of TDP-43 aggregation by artificial peptide binder targeting to its low complexity domain (2023)
  • Author(s): Kamagata Kiyoto、Kanbayashi Saori、Koda Shuichi、Kadotani Akito、Ubukata Osamu、Tashima Takumi
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 662 Pages: 119-125
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2023.04.064
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rational design of phase separating peptides based on phase separating protein sequence of p53 (2023)
  • Author(s): Kamagata Kiyoto、Hando Atsumi、Ariefai Maulana、Iwaki Nanako、Kanbayashi Saori、Koike Ryotaro、Ikeda Keisuke
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 13 Issue: 1 Pages: 5648-5648
  • DOI: 10.1038/s41598-023-32632-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 非ドメイン型タンパク質の相分離を制御するバインダーペプチドと相分離ペプチドの合理的設計 (2023)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Journal Title: Medical Science Digest Volume: 49 Pages: 481-484
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure-dependent recruitment and diffusion of guest proteins in liquid droplets of FUS (2022)
  • Author(s): Kamagata Kiyoto、Iwaki Nanako、Kanbayashi Saori、Banerjee Trishit、Chiba Rika、Gaudon Virginie、Castaing Bertrand、Sakomoto Seiji
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 7101-7101
  • DOI: 10.1038/s41598-022-11177-w
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Giant Carbon Nano-Test Tubes as Versatile Imaging Vessels for High-Resolution and In Situ Observation of Proteins (2022)
  • Author(s): Tracy T Chuong, Toshihiko Ogura, Norihito Hiyoshi, Kazuma Takahashi, Sangho Lee, Keita Hiraga, Hiroki Iwase, Akira Yamaguchi, Kiyoto Kamagata, Eriko Mano, Satoshi Hamakawa, Hirotomo Nishihara, Takashi Kyotani, Galen D Stucky, Tetsuji Itoh
  • Journal Title: ACS Applied Materials & Interfaces Volume: 14 Issue: 23 Pages: 26507-26516
  • DOI: 10.1021/acsami.2c06318
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Rational peptide design for regulating liquid-liquid phase separation on the basis of residue-residue contact energy (2022)
  • Author(s): Kamagata Kiyoto、Ariefai Maulana、Takahashi Hiroto、Hando Atsumi、Subekti Dwiky Rendra Graha、Ikeda Keisuke、Hirano Atsushi、Kameda Tomoshi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 13718-13718
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17829-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 疾患関連相分離タンパク質をターゲットとしたペプチドバインダーの設計 (2022)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Journal Title: 日薬理誌 Volume: 157 Pages: 392-395
• [Presentation] Design of phase separating peptide and peptide-based regulation of phase separation of drug-target disordered proteins. (2023)
  • Author(s): Kamagata K.
  • Organizer: Polymers-2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] DNA液滴中でのDNA結合タンパク質の標的探索運動の単分子解析 (2023)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 第46回 日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] DNA液滴でのDNA結合タンパク質の単分子解析および相分離ペプチドの合理的設計 (2023)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 第61回 日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] 蛋白質液滴を測り、操り、創る (2023)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: CSJ化学フェスタ
  • Invited
• [Presentation] 相分離タンパク凝集体をほぐす分子モーターシステムの設計と課題 (2023)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 第12回分子モーター討論会
  • Invited
• [Presentation] Single molecule microscopy reveals that importin α slides along DNA while transporting cargo molecules (2023)
  • Author(s): Trishit Banerjee, Kazuya Jibiki, Noriko Yasuhara, and Kiyoto Kamagata
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] Single molecule microscopy reveals that importin α slides along DNA while transporting cargo molecules (2023)
  • Author(s): Trishit Banerjee, Kazuya Jibiki, Noriko Yasuhara, and Kiyoto Kamagata
  • Organizer: 第61回 日本生物物理学会年会
• [Presentation] Elucidating fusion dynamics of FUS protein droplets using fluorescence microscopy and optical tweezers (2023)
  • Author(s): Syamil M. A. Husna, Atsumi Hando, Saori Kanbayashi, and Kiyoto Kamagata
  • Organizer: 第61回 日本生物物理学会年会
• [Presentation] Single-molecule characterization of DNA-binding protein action on DNA and engineering of genome editing protein Cas9 for improving its function. (2022)
  • Author(s): Kamagata K.
  • Organizer: European Nucleic Acids 2022
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 天然変性タンパク質を標的としたペプチドバインダーの合理的設計 (2022)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 第7回タタバイオ分子クラブ
  • Invited
• [Presentation] がん疾患関連タンパク質p53の液-液相分離と人工ペプチドによる制御 (2022)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 2022年度 日本分光学会NMR分光部会 集中講義
  • Invited
• [Presentation] 液-液相分離会合体の分子取り込みと 並進拡散運動に関する分子文法解析 (2022)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 第60回 日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] 患関連相分離タンパク質を標的としたペプチドバインダーの設計法の開発 (2022)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 第73回日本薬理学会北部会
  • Invited
• [Presentation] 液-液相分離会合体の分子取り込みと並進拡散運動に関する分子文法解析 (2022)
  • Author(s): 鎌形清人
  • Organizer: 第6回LLPS研究会
  • Invited
• [Presentation] 液-液相分離会合体の分子取り込みと並進拡散運動に関する分子文法解析 (2022)
  • Author(s): 鎌形清人、岩城奈々子、Yaakov Levy
  • Organizer: 第22回蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] がん抑制タンパク質p53から合理的に設計した相分離ペプチドの物性評価 (2022)
  • Author(s): 飯藤淳実, マウラナアリエファイ, 岩城奈那子, 上林さおり, 小池亮太郎, 池田恵介, 鎌形清人
  • Organizer: 第22回東北大学多元物質科学研究所研究発表会
• [Presentation] Rational design of phase-separating peptides based on natural phase-separating protein disordered sequence (2022)
  • Author(s): Hando A, Ariefai M, Iwaki N, Kanbayashi S, Ikeda K, Kamagata K
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Single-molecule characterization of target search of DNA-binding proteins inside liquid DNA droplets (2022)
  • Author(s): Kusano R, Banerjee T, Kanbayashi S, Ikeda K, Kamagata K
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Engeneering of DNA sliding ability and target search elucidation of Cas-family proteins using single-molecule analysis (2022)
  • Author(s): Banerjee T, Takahashi H, Subekti D R G, Kamagata K
  • Organizer: 第22回蛋白質科学会年会
• [Remarks] DNA結合タンパク質が標的を探す仕組みを解明 液―液相分離したDNA液滴中での追跡に成功
  • URL: https://www.tohoku.ac.jp/japanese/2023/06/press20230609-02-dna.html
• [Remarks] 東北大、DNA結合タンパク質が標的を探す仕組みを解明
  • URL: https://www.nikkei.com/article/DGXZRSP656948_Z00C23A6000000/