Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
核小体は、非ドメイン型バイオポリマーが集約し液―液相分離によって形成される非膜オルガネラである。本研究ではヒートショックなどのストレス時における核小体のアミロイド様化に注目し、RNAポリメラーゼIにより合成される非ドメイン型ノンコーディングRNAが核小体の相転移を制御する仕組みを明らかにする。これを通して非ドメイン型バイオポリマーがどのように機能を獲得するのかを理解することに貢献する。
核小体は、非ドメイン型バイオポリマーが集約し液―液相分離によって形成される非膜オルガネラである。研究代表者は、細胞内一分子イメージング法によりリボソーム合成時にRNAポリメラーゼI（Pol I）が局在する核小体内層(FC)が大量のリボソームRNA(rRNA)のため、相分離を起こした液滴（ドロプレット）というよりむしろ、より粘性の高いゲル状になることを見出している。本研究ではヒートショックなどのストレス時における核小体のアミロイド様化に注目し、Pol Iにより合成される非ドメイン型ノンコーディングRNA(ncRNA)が核小体の相転移を制御する仕組みを明らかにすることを目的とした。令和4年度はストレス時にPol Iが本来の鋳型rRNA遺伝子以外のゲノム領域から合成するncRNAを網羅的に同定することを試みた。異なる方法でPol Iをノックダウンし、RNAシーケンス（RNA-seq）をした。その結果、予備実験により見出した有力な候補も含め再現性が高く減少するncRNAが見つからなかった。今後、リピート配列を含んだヒト完全ゲノムT2Tをリファレンスとして用いたRNA-seq解析を行っていく。
4: Progress in research has been delayed.
これまでncRNAがPol I依存的に合成されるかどうかをタンパク質分解除去できるAID法によってPol Iをノックダウンした時その量が減少することを指標に評価し、候補となるncRNAを特定してきた。この結果を異なるアプローチで確認した。具体的にはPol Iの転写に必須なクロマチン因子UBFに依存的に新規合成されるncRNAを特定することにした。Pol Iと同様に、UBFをAID法によって迅速に分解できる細胞株を用いて、アミロイド様凝集体を誘発した時にUBFノックダウンとともにその発現が減少するncRNAを次世代シークエンサーで網羅的に同定することを試みた。ところが、Pol I依存的に合成されるncRNAの有力候補であると考えていたヒストン遺伝子クラスター領域のncRNAが検出できなかった。さらに予備実験に使用した株とは独立に作製したPol Iノックダウン細胞株においても確認したところ、ヒストン遺伝子クラスター領域由来のncRNAの低下は観察されなかった。そこでストレス応答時、Pol Iがヒストン遺伝子クラスター領域を転写しているかを明らかにするために、Pol IとHLBマーカータンパク質NPATの経時観察した。その結果、ストレス時に２つの輝点が近接したり、共局在する様子は見られなかった。このことから、有力候補であるヒストン領域由来のncRNAがPol Iで転写されたものでないと結論付けた。
今後、Pol Iによって転写されるncRNAを同定するために、Pol Iをノックダウンした時のRNA-seqデータとUBFをノックダウンした時のRNA-seqデータで共通してその発現が減少しているものを調べていく。これまでRNA-seq解析の際にリファレンスとしてヒトゲノムhg38を使用してきたが、最近公表された完全ヒトゲノムT2Tを用いる。T2Tゲノムはこれまでのリファレンスで除外されていたテロメア、セントロメア、rRNA遺伝子の周りのリピート配列を含んでおり、これらリピート配列も対象にし調べていく。
All 2022 Other
All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 1 results, Open Access: 1 results) Presentation (2 results) (of which Invited: 2 results) Remarks (1 results)
BioEssays
Volume: 44 Issue: 7 Pages: 2200043-2200043
10.1002/bies.202200043
実験医学増刊号 セントラルドグマの新常識
Volume: 40 Pages: 32-41
生化学 特集「今，解き明かされつつある液-液相分離による生体機能制御」椎名伸之、奥野浩行編
Volume: 94 Pages: 485-493
https://www.nig.ac.jp/nig/ja/2022/06/research-highlights_ja/rh20220605.html
