高エネルギー構造の解明による蛋白質構造揺らぎの可視化

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 23107729
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 北原 亮 立命館大学, 薬学部, 准教授 (70512284)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000); Fiscal Year 2012: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2011: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
• Keywords: 高圧力 / 蛋白質 / 揺らぎ / 変性 / 準安定構造 / NMR / 構造揺らぎ / ユビキチン

Outline of Annual Research Achievements

蛋白質構造において、天然状態を逸脱した高エネルギー状態の存在が溶液NMR法で確認されているが、構造やダイナミクス、安定性の解析、機能的意義の解明は天然状態ほど進んでいない。蛋白質の高エネルギー状態を圧力下で安定化させ、NMRによる立体構造を行い、最安定状態から変性状態までの一連の構造変化を可視化する事ができる。これまでに高圧力NMR法によりユビキチンには、最安定状態N1の他に準安定状態N2や局所変性状態I、完全変性状態Dが存在することを明らかにしてきた。また3000気圧下でN2構造を78%まで分布させ、立体構造解析に成功している。N2構造の精密構造解析や、機能的意義の研究のために１気圧下でN2構造が安定化された変異体を合理的に設計することを試みた。
1気圧下でのN1構造と3000気圧下でのN2構造の立体構造比較から、I36-Q41間の水素結合長とK11-E34間の塩橋が大きく変化していることが明らかになった。そこで、水素結合と塩橋の相互作用を減弱させるためにQ41A, Q41N, K11A, E34A変異体を作成し、高圧力NMR測定を含む各種NMR測定に基づいて、立体構造、ダイナミクス、熱力学的安定性の解析を行った。
圧力(3000-30 bar)による化学シフト変化と変異による化学シフト変化に相関がみられたことから、加圧時と同様に変異によってもN2構造の安定化が示唆された。最も化学シフト変化量が大きいQ41Nについて、高圧力NMR法によりN2構造の分布率が70％程度と分かった。距離情報(NOE)と角度情報(RDC, TALOS+)からQ41Nの精密な立体構造に成功した。Q41Nは、8-44-70からなる疎水性パッチの構造は保持しつつも、高圧下で決定されたWTのN2構造と同様に、α-helix, loop, β3-strand, β5-strandの配向が変化していた。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Exploring the folding energy landscape with pressure (2013)
  • Author(s): K. Akasaka, R. Kitahara, Y. O. Kamatari
  • Journal Title: Arch. biochem. biophys Volume: 531 Issue: 1-2 Pages: 110-115
  • DOI: 10.1016/j.abb.2012.11.016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Solution structure of the Q41N variant of ubiquitin as a model for the alternatively folded N2 state of ubiquitin (2013)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, Tomoshi Kameda, Maho Yagi-Utsumi, Kenji Sugase, Nicola J. Baxter, Koichi Kato, Michael P. Williamson, Ryo Kitahara.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 52 Issue: 11 Pages: 1874-1885
  • DOI: 10.1021/bi301420m
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pressure-induced chemical shifts as probes for conformational fluctuations in proteins (2013)
  • Author(s): Kitahara R, Hata K, Li H, Williamson MP, Akasaka K.
  • Journal Title: Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. Volume: 71 Pages: 35-58
  • DOI: 10.1016/j.pnmrs.2012.12.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 高圧力NMR法で観る蛋白質の高エネルギー構造 (2012)
  • Author(s): 北原亮
  • Journal Title: Bulltin of the nuclear magnetic resonance society of Japan Volume: 3 Pages: 46-50
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A delicate interplay of structure, dynamics and thermodynamics for function. A high pressure NMR and fluorescence study of Outer surface protein A (2012)
  • Author(s): Kitahara R., Simorellis A.K., Hata K., Maeno A., Yokoyama, S., Koide S., Akasaka K.
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 102 Issue: 4 Pages: 916-926
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2011.12.010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural plasticity of staphylococcal nuclease probed by perturbation with pressure and pH (2011)
  • Author(s): Kitahara R., Hata K.Maeno A., Akasaka K., Chimenti M.S., Garcia-Moreno B.E., Schroer M.A., Jeworrek C., Tolan M., Winter R., Roche J., Roumestand C., de Guillen K.M., Royer C.
  • Journal Title: Protein Science Volume: 79 Issue: 4 Pages: 1293-1305
  • DOI: 10.1002/prot.22966
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Pressure induced chemical shifts as probes for conformational fluctuations in proteins (2012)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Hua Li, M. P. Williamson, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: The 6th international symposium Molecular Science of fluctuations toward biological functions
  • Place of Presentation: 京都テルサ、京都府
  • Year and Date: 2012-12-05
• [Presentation] Solution structure of the alternatively folded state of ubiquitin (2012)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, TOmoshi Kameda, Maho Yagi-Utsumi, Kenji Sugase, Nicola Baxter, Koichi Kato, M. P. Williamson, Ryo Kitahara
  • Organizer: The 6th international symposium Molecular science of fluctuations toward biological functions
  • Place of Presentation: 京都テルサ、京都府
  • Year and Date: 2012-12-05
• [Presentation] Pressure induced chemical shifts as probes for conformational fluctuations in proteins (2012)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Hua Li, Michael P. Williamson, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 第51回NMR討論会
  • Place of Presentation: ウインクあいち、愛知県
  • Year and Date: 2012-11-08
• [Presentation] ユビキチンの高エネルギー状態N2の立体構造解明 (2012)
  • Author(s): 北沢創一郎、亀田倫史、矢木真穂、菅瀬謙治、Nicola Baxter, 加藤晃一、Michael P. Williamson、北原亮
  • Organizer: 第51回NMR討論会
  • Place of Presentation: ウインクあいち、愛知県
  • Year and Date: 2012-11-08
• [Presentation] キャビティーが決める蛋白質構造の揺らぎ：T4リゾチームの13C, 15N, 1H高圧NMR (2012)
  • Author(s): 前野覚大、北原亮、横山茂之、F. W. Dahlquist, F. F. A. Mulder, 赤坂一之
  • Organizer: 第51回NMR討論会
  • Place of Presentation: ウインクあいち、愛知県
  • Year and Date: 2012-11-08
• [Presentation] Pressure induced chemical shifts as probes for conformational fluctuations in proteins (2012)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Hua Li, MIke Williamson, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 7th International Conference on High Pressure Bioscience and Biotechnology
  • Place of Presentation: ピアザ淡海、滋賀県
  • Year and Date: 2012-10-29
• [Presentation] Solution structure of high Gibbs free energy state of ubiquitin (2012)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, Tomoshi Kameda, Maho Yagi, Kenji Sugase, Nicky Baxter, Koichi Kato, Mike Williamson, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 7th International Conference on High Pressure Bioscience and Biotechnology
  • Place of Presentation: ピアザ淡海、滋賀県
  • Year and Date: 2012-10-29
• [Presentation] Solution structure of the alternatively folded state of ubiquitin (2012)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, TOmoshi Kameda, Maho Yagi, Kenji SUgase, Nicola Baxter, Koichi Kato, Michael P. Williamson, Ryo Kitahara
  • Organizer: 第５０回生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学東山キャンパス、愛知県
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] Conformational fluctuation of ubiquitin probed by perturbation with pressure and mutation (2012)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Soichiro Kitazawa, Maho Yagi-Utsumi, Nicky Baxter, Mike Williamson, and Koichi Kato
  • Organizer: XXVth ICMRBS
  • Place of Presentation: リヨン、フランス
  • Year and Date: 2012-08-20
• [Presentation] NOE-derived solution structure of the high-energy open conformer N2 of ubiquitin (2012)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, Tomoshi Kameda, Maho Yagi-Utsumi, Kenji Sugase, Koichi Kato, Ryo Kitahara
  • Organizer: XXVth ICMRBS
  • Place of Presentation: リヨン、フランス
  • Year and Date: 2012-08-20
• [Presentation] 準安定構造に着目した構造-機能相関:ユビキチン、ジユビキチン (2012)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: 第3回バイオ単分子研究会
  • Place of Presentation: 新世代研究所会議室(東京都)(招待講演)
  • Year and Date: 2012-03-09
• [Presentation] DESIGN STRATEGY FOR HIGH FREE-ENERGY STATES OF PROTEINS BASED ON HIGH-PRESSURE NMR STUDY : ALTERNATIVELY FOLDED CONFORMATION OF UBIQUITIN (2012)
  • Author(s): Kitahara R., Kitazawa S., Yagi-Utsumi M., Ido A., Urushitani M., Sugase K., Kato K.
  • Organizer: Biophysical Society 56th Annual Meeting
  • Place of Presentation: サンディエゴUSA
  • Year and Date: 2012-02-26
• [Presentation] Structure and Function of NMR "invisible" states of proteins (2012)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: よこはま構造生物学研究会第43回ワークショップ
  • Place of Presentation: 理化学研究所横浜研究所交流棟ホール(神奈川県)(招待講演)
  • Year and Date: 2012-02-06
• [Presentation] High pressure NMR reveals a delicate interplay of protein's structure, dynamics, and thermodynamics for function (2012)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: RRR国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 首都大学東京秋葉原サテライトキャンパス(東京都)
  • Year and Date: 2012-01-25
• [Presentation] Structure, dynamics and function of high-energy state mutant of ubiquitin : Structure, dynamics and function of high-energy state mutant of ubiquitin (2012)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, Maho Yagi-Utsumi, Kenji Sugase, Koichi Kato, Ryo Kitahara
  • Organizer: The 5th International Symposium for Molecular Science of Fluctuations to ward Biological Functions
  • Place of Presentation: 東大寺総合文化センター(奈良県)
  • Year and Date: 2012-01-07
• [Presentation] Two natively folded conformations of folate-bound forms of E.coli DHFR-D27E mutant (2012)
  • Author(s): Tomoko Kunihara, Soichiro Kitazawa, Naohiro Kobayashi, Eiji Ohmae, Ryo Kitahara
  • Organizer: The 5th International Symposium for Molecular Science of Fluctuations to ward Biological Functions
  • Place of Presentation: 東大寺総合文化センター(奈良県)
  • Year and Date: 2012-01-07
• [Presentation] Two natively folded conformations of folate-bound form of E.Coli DHFR-D27E mutant (2011)
  • Author(s): Tomoko Kunihara, Soichiro Kitazawa, Naohiro Kobayashi, Eiji Ohmae, Ryo Kitahara
  • Organizer: ISNMR
  • Place of Presentation: 大さん橋ホール(神奈川県)
  • Year and Date: 2011-11-15
• [Presentation] Conformational fluctuation of Lys48-linked diubiquitin studied by high pressure NMR spectroscopy (2011)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Takashi Hirano, Maho Yagi, Kazumi Hata, Kazuyuki Akasaka, Koichi Kato
  • Organizer: ISNMR
  • Place of Presentation: 大さん橋ホール(神奈川県)
  • Year and Date: 2011-11-15
• [Presentation] 高圧力NMRによる構造生物学の新展開 (2011)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: NEDO特別講演会
  • Place of Presentation: 東京大学薬学部講堂(東京都)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-10-13
• [Presentation] Cavity hydration and the dynamics of a protein (2011)
  • Author(s): 前野覚大、北原亮、鎌足雄司、Sunilkumar PN、赤坂一之
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-17
• [Presentation] High pressure NMR discloses a rich world of high-energy structures of proteins (2011)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] Cavity hydration as a gatewayto internal movility : A high pressure 13C and 15N NMR study of T4 lysozyme (2011)
  • Author(s): Akihiro Maeno, Ryo Kitahara, Fredelrick Dahlquist, Shegeyuki Yokoyama, Frans Mulder, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] A design strategy of high-energy states of proteins based on high pressure NMR study (2011)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, Maho Yagi, Kenji Sugase, Koichi Kato, Ryo Kitahara
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] 蛋白質の準安定状態に着目した新しい構造生物学の展開 (2011)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: 蛋白質研究所セミナー
  • Place of Presentation: 大阪大学蛋白研究所(大阪府)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-07-29
• [Presentation] 高圧力NMRで観る蛋白質の高エネルギー構造と水和 (2011)
  • Author(s): 北原亮、前野覚大、赤坂一之
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク(大阪府)
  • Year and Date: 2011-06-09
• [Presentation] ユビキチンの高エネルギー構造安定化変異体 (2011)
  • Author(s): 北沢創一郎、矢木真穂、菅瀬謙治、加藤晃一
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク(大阪府)
  • Year and Date: 2011-06-08
• [Presentation] タンパク質の高エネルギー構造に注目した新しい構造生物学の展開 (2011)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: 第2回若手育成講習会
  • Place of Presentation: 大阪大学蛋白研究所(大阪府)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-04-26
• [Book] 生体分子の動きを探る (2013)
  • Author(s): 寺嶋正秀 編
  • Publisher: 化学同人
• [Book] 広がるNMRの世界 (2011)
  • Author(s): 朝倉哲郎編著
  • Publisher: コロナ社
• [Remarks] 立命館大学薬学部 生体分子構造学研究室
  • URL: http://www.ritsumei.ac.jp/pharmacy/kitahara/kitahara_lab.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.ritsumei.ac.jp/phamacy/kitahara/kitahara_lab.html