原核生物多剤耐性トランスポーターの構造揺らぎと薬剤排出活性のＮＭＲ解析

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 23107735
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 竹内 恒 独立行政法人産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 主任研究員 (20581284)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2012: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2011: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 核磁気共鳴 / 立体構造解析 / 多剤耐性 / 構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

１原核生物は様々な薬剤に対して耐性を獲得するため、細胞膜上に多剤耐性トランスポーターを発現させている。一方、多剤耐性トランスポーターの発現は、多剤耐性転写制御因子（MDR-GR）により制御されており、MDR-GRが細胞内に侵入した薬剤を認識し、多剤排出トランスポーターの転写を亢進させることでその細胞膜上での発現を増大させる巧妙なシステムが構築されている。本年度はこのMDR-GRに着目し、研究を推進した。MDR-GRにはTetR, MerR, PadRと３種類のファミリーが知られており、それぞれ異なる多剤認識機構を持つと考えられる。そのうちPadRファミリーに属するLmrRは、他のMDR-GRとは異なり二量体形成面において挟み込むようにして１分子の薬剤を認識するため、薬剤の多様な構造に合わせて、分子全体の構造を変化させる必要がある。LmrRの薬剤非結合状態、結合状態における運動性を比較することで、分子の揺らぎと多剤認識機構との関係をNMRを用いて解析した。薬剤が結合していない状態において解析を行ったところ、薬剤認識部位のシグナル強度がその他の部位に比べて顕著に低く、またシグナルが観測されない残基が複数存在することが判明した。またLmrRの主鎖アミド基の緩和解析を行った結果、N, C末端およびループ部分以外にC末端薬剤結合へリックスの一部がps-ns領域の早い運動性を示すことが明らかとなった。またN, C末端薬剤結合へリックスは全領域にわたり大きなT1/T2値を示し、ms-usの遅い運動性を有することが明らかとなった。これらの結果はLmrRが非結合状態においては薬剤結合部位に多型を保持することで、様々な薬剤に対する結合親和性を保障していることを示唆し、多剤耐性薬物トランスポーター等の基質認識機構の理解にもつながるものと考える。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] A homogeneous, high-throughput assay for phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase with a novel, rapid substrate preparation (2013)
  • Author(s): Davis MI, Sasaki AT, Shen M, Emerling BM, Thorne N, Michael S, Pragani R, Boxer M, Sumita K, Takeuchi K, Auld DS, Li Z, Cantley LC, Simenov A
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 8 Issue: 1 Pages: e54127-e54127
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0054127
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for the Golgi association by the pleckstrin homology domain of the ceramide trafficking protein (CERT) (2012)
  • Author(s): Sugiki T, Takeuchi K, Yamaji T, Takano T, Tokunaga Y, Kumagai K, Hanada K, Takahashi H, and Shimada I
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 287 Issue: 40 Pages: 33706-33718
  • DOI: 10.1074/jbc.m112.367730
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional dynamics of proteins revealed by solution NMR (2012)
  • Author(s): Osawa M, Takeuchi K, Ueda T, Nishida N, Shimada I.
  • Journal Title: Curr Opin Struct Biol Volume: 22 Issue: 5 Pages: 660-669
  • DOI: 10.1016/j.sbi.2012.08.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional equilibrium of the KcsA structure revealed by NMR (2012)
  • Author(s): Imai S, Osawa M, Mita K, Toyonaga S, Machiyama A, Ueda T, Takeuchi K, Oiki S, Shimada I.
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 287 Issue: 47 Pages: 39634-39641
  • DOI: 10.1074/jbc.m112.401265
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Low g-nuclei detection experiments for bimolecular NMR (2012)
  • Author(s): Takeuchi K, Gal M, Shimada I, Wagner G
  • Journal Title: Recent Developments in Biomolecular NMR Volume: (印刷中)
• [Journal Article] Structure of the VP16 transactivator target in the Mediator (2011)
  • Author(s): Milbradt AG, Kulkarni M, Yi T, Takeuchi K, Sun ZY, Luna RE, Selenko P, Naar AM, Wagner G
  • Journal Title: Nat Struct Mol Biol Volume: 18 Issue: 4 Pages: 410-415
  • DOI: 10.1038/nsmb.1999
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein-ligand docking guided by ligand pharmacophore-mapping experiment by NMR (2011)
  • Author(s): Fukunishi Y, Mizukoshi Y, Takeuchi K, Shimada I, Takahashi H, Nakamura H.
  • Journal Title: J Mol Graph Model Volume: 31 Pages: 20-27
  • DOI: 10.1016/j.jmgm.2011.08.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Speeding up direct (15) N detection : hCaN 2D NMR experiment (2011)
  • Author(s): Gal M, Edmonds KA, Milbradt AG, Takeuchi K, Wagner G
  • Journal Title: J Biomol NMR Volume: 51 Issue: 4 Pages: 497-504
  • DOI: 10.1007/s10858-011-9580-7
  • Peer Reviewed
• [Presentation] NMR approach to study and interfere with blood coagulation responses (2012)
  • Author(s): 竹内恒
  • Organizer: 難治性疾患統合創薬プロジェクト講演会
  • Place of Presentation: 滋賀県・立命館大学(招待講演)
  • Year and Date: 2012-01-30
• [Presentation] 多剤耐性転写制御因子の揺らぎによる薬剤認識機構 (2012)
  • Author(s): 竹内 恒、嶋田 一夫
  • Organizer: 新学術領域「揺らぎと生体機構」「水和とATP」合同公開シンポジウム「ゆらぎと水－生命のエネルギーと機能の分子機構を探る」
  • Place of Presentation: 大阪府大阪市・大阪ガーデンパレス
• [Presentation] 酵母K.Lactis発現系を用いた高分子量蛋白質の重水素化およびメチル選択標識 (2012)
  • Author(s): 宮沢-大浪 真由美,竹内 恒, 杉木 俊彦, 高野 等覚, 嶋田 一夫, 高橋 栄夫
  • Organizer: 第51回NMR討論会
  • Place of Presentation: 愛知県名古屋市・ウインクあいち
• [Presentation] NMR Analysis of Functional Fluctuation in Large Molecular Weight Protein (2012)
  • Author(s): 竹内恒、徳永裕二、高橋栄夫、嶋田一夫
  • Organizer: 新学術領域「揺らぎが機能を決める生命分子の科学」国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 奈良県・東大寺(招待講演)
• [Presentation] HNCA-TOCSY-CANH experiments with alternate 13C-12C labeling : a set of 3D experiment with unique supra-sequential information for mainchain resonance assignment (2011)
  • Author(s): Koh Takeuchi, Maayan Gal, Hideo Takahashi, Gerhard Wagner, Ichio Shimada
  • Organizer: ISNMR2011
  • Place of Presentation: 神奈川県・大桟橋ホール
  • Year and Date: 2011-11-16
• [Presentation] T細胞レセプターはダイナミックかつ協同的な4次元構造変化により活性化する-NMRおよび光ピンセット法による解析- (2011)
  • Author(s): 竹内恒、嶋田一夫
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県・姫路工大(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] T細胞活性化のしくみTCRはナノマシーンか?-NMRおよび光ピンセット法による解析- (2011)
  • Author(s): 竹内恒、嶋田一夫
  • Organizer: 第6回構造生物学に関する先端技術講演会
  • Place of Presentation: 福岡県・九州大学(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-02
• [Remarks] http://unit.aist.go.jp/birc2/
• [Remarks]
  • URL: http://unit.aist.go.jp/birc2/