Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
我々が開発したテルペン活性のスクリーニング法では、基質消費活性が高いほど、つまり細胞活性が高いほど「より白い」コロニを形成する。「白さ」を指標として、テルペン酵素の細胞活性をハイスループットに見積もることができる。これを用いて，以下２つの方向で実験を行った。(1) タバコ由来5-epi-aristolochene（防カビ剤の前駆体）合成酵素(TEAS)，イチイ由来のタキサジエン（抗がん剤タキソールの前駆体）合成酵素（TaxS）を変異PCR法によってランダム変異 (～2変異/gene/世代)を導入し，ライブラリ化（多様化）した。つぎに，それぞれを黄色ブドウ球菌由来のC30カロテノイド合成経路とともにひとつの大腸菌内に発現させた。活性の無い酵素変異体の導入された大腸菌は，色素由来の黄色いコロニを与えたが，活性をもつ変異体を導入した細胞は，白っぽいコロニを与える。白いコロニから得た配列をサンプリングして解読したところ，ストップコドンやフレームシフト，そして重篤な構造破壊／機能低下をもたらす変異は完全に除去されていた。こうして，世界で初めて，テルペン酵素としての機能におけるMutability mapが描けることができるようになった。(2) ゲラニオール酵素とTEASの２つの酵素について，ランダム変異→活性スクリーニング活性変異体を調べたところ，親よりも白いコロニーを幾つも得た。これらを解析したところ，細胞活性は有意に向上していたが，おもに異種発現性の向上によって説明できるものが殆どであった。
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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Methods Mol Biol
Volume: 892 Pages: 879-5
10.1007/978-1-61779-879-5_14
Anal Sci
Volume: 28 Pages: 95-101
10030446436
http://chem.tf.chiba-u.jp/~umeno/
