原核生物Ｐ４５０を機能発現する植物形質転換系の構築

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 23108514
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 水谷 正治 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60303898)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2012: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2011: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
• Keywords: P450 / アグロインフィルトレーション / 葉緑体 / クマリン / Nicotiana benthamiana / 植物形質転換

Outline of Annual Research Achievements

本課題では、（１）P450の活性を短時間で評価できる植物形質転換系の構築を行うこと、次に、構築した植物形質転換系を用いて、（２）P450を葉緑体で機能させるための植物発現系の開発を行なうことを目的とした。タバコ（Nicotiana benthamiana）を利用したアグロインフィルトレーション法は、発現ベクターで形質転換したアグロバクテリウムをシリンジでタバコ葉に注入することにより、数日後に目的遺伝子を一過的に発現させるという方法であり、複数の生合成遺伝子を同時に植物へ導入して一過的過剰発現を行うことにより、植物体内での目的代謝産物の生成を短時間で評価できる。
今回、モデルP450としてヒト由来ミトコンドリア局在型P450であるCYP11Aと、植物由来ステロイド水酸化P450 であるCYP90Bを用いて発現系を構築した。ヒトCYP11AはN末をER局在シグナルと葉緑体局在シグナルに改変した発現ベクターを構築した。一方、CYP90Bはそのまま過剰発現させることとした。CYP90B発現ベクターを導入したアグロバクテリウムをタバコ葉にアグロインフィルトレーションし感染3日後の葉をGCMSにより分析した結果、ステロイド22位水酸化物を検出することができた。このことから本発現方法によりP450を植物で一過的発現させることによりP450活性を評価できることを確認した。現在、CYP11A発現系を解析中である。次に、P450が葉緑体の電子伝達系とカップリングできることを確認するため、大腸菌で発現させたCYP90Bをタバコ由来チラコイド膜と混合して、In vitroで酵素アッセイを行った。その結果、光依存的に酵素活性を検出することができたことから、チラコイド膜上の電子伝達系から光依存的にP450へ電子が伝達されることを確認した。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] CYP901A1/CPD, a brassinosteroid biosynthetic cytochrome P450 of Arabidopsis, catalyzes C-3 oxidation (2012)
  • Author(s): Toshiyuki Ohnishi
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 287 Issue: 37 Pages: 31551-31560
  • DOI: 10.1074/jbc.m112.392720
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rice CYP90D2 and CYP90D3 catalyze C-23 hydroxylation of brassinosteroids in vitro. (2012)
  • Author(s): Sakamoto T（責任著者）, Ohnishi T, Fujioka S, Watanabe B, and Mizutani M.
  • Journal Title: Plant Physiology and Biochemistry Volume: 58 Pages: 220-226
  • DOI: 10.1016/j.plaphy.2012.07.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impacts of diversification of cytochrome P450 on plant metabolism. (2012)
  • Author(s): Mizutani M.
  • Journal Title: Biol Pharm Bull. Volume: 35 Pages: 824-832
  • NAID: 130001872160
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase from Ruta graveolens L. exhibits p-coumaroyl CoA 2'-hydroxylase activity (C2'H): a missing step in the synthesis of umbelliferone in plants. (2012)
  • Author(s): Vialart G, Hehn A, Olry A, Ito K, Krieger C, Larbat R, Paris C, Shimizu B, Sugimoto Y, Mizutani M, Bourgaud F.
  • Journal Title: Plant J Volume: 70 Issue: 3 Pages: 460-470
  • DOI: 10.1111/j.1365-313x.2011.04879.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Triterpene functional genomics in licorice for identification of CYP72A154 involved in the biosynthesis of glycyrrhizin (2011)
  • Author(s): Seki, H., et al
  • Journal Title: Plant Cell Volume: 23 Issue: 11 Pages: 4112-4123
  • DOI: 10.1105/tpc.110.082685
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] CYP716A subfamily members are multifunctional oxidases in triterpenoid biosynthesis (2011)
  • Author(s): Fukushima, E.O., Seki, H., Ohyama, K., Ono, E., Umemoto, N., Mizutani, M., Saito, K., Muranaka, T.
  • Journal Title: Plant Cell Physiology Volume: 52 Issue: 12 Pages: 2050-2061
  • DOI: 10.1093/pcp/pcr146
  • NAID: 10030306130
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Biochemical characterization of the pathways of biosynthesis and catabolism of brassinosteroids (2012)
  • Author(s): Masaharu Mizutani
  • Organizer: 1st International Brassinosteroid Conference
  • Place of Presentation: Barcelona, Spain
  • Year and Date: 2012-06-27
  • Invited
• [Presentation] Functional diversity of plant P450s involved in steroid and triterpenoid biosynthesis. (2012)
  • Author(s): Masaharu Mizutani
  • Organizer: 11th International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity and Biotechnology
  • Place of Presentation: Torino, Italy
  • Year and Date: 2012-06-22
  • Invited
• [Presentation] Functional diversity of plant P450s involved in steroid and triterpenoid biosynthesis. (2012)
  • Author(s): Masaharu Mizutani
  • Organizer: 8th U.S.-Japan Seminar on the Biosynthesis of Natural Products
  • Place of Presentation: Awaji, Japan
  • Year and Date: 2012-06-17
• [Presentation] クマリン類生合成の鍵酵素である桂皮酸類オルト位水酸化酵素の解析 (2011)
  • Author(s): 水谷正治、伊藤杏子、清水文一、杉本幸裕
  • Organizer: 第29回日本植物細胞分子生物学会
  • Place of Presentation: 九州大学箱崎キャンパス
  • Year and Date: 2011-09-07