ステロイド類生合成修飾酵素を活用した有用物質生産系の構築

Publicly Offered Research

Project Area	Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
Project/Area Number	23108527
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Science and Engineering
Research Institution	Meiji University
Principal Investigator	久城哲夫明治大学, 農学部, 准教授 (80373299)
Project Period (FY)	2011-04-01 – 2013-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2012)
Budget Amount *help	¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000) Fiscal Year 2012: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000) Fiscal Year 2011: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Keywords	ステロイド / 酸化酵素 / 生合成 / 糸状菌 / ヘルボール酸
Outline of Annual Research Achievements	ステロイドやトリテルペノイド化合物の骨格修飾に関与する酸化酵素群を数多く同定することは、有用物質生産へ向けた重要な生合成マシナリーツールを提供することにつながる。糸状菌Aspergillus fumigatusが生産するヘルボール酸は、プロトステロール骨格が高度に酸化修飾された構造を有しており、本生合成遺伝子クラスター内の酸化酵素群を機能解析することで骨格修飾に関与する酵素遺伝子を多数同定することが可能である。これまでに、クラスター内のシトクロムP450酸化酵素（P450）であるCYP5081A1、ならびにデヒドロゲナーゼ（AfuSDR）の機能解析に成功しており、各々プロトステロールの29位メチル基の酸化および3位水酸基の酸化を行っていることが判明している。そこで、クラスター内の他のP450遺伝子の機能解析を試みた。クラスター内の残り3種類のP450遺伝子、CYP5081B1、C1、D1を各々pESCベクターに導入し、プロトスタジエノール合成酵素（AfuOSC）との酵母共発現系の構築を行った。さらに、P450の活性を高める目的で、A. fumigatus由来の2種類のP450還元酵素（CPR1、CPR2）のクローニングを行い、OSCや各々のP450との共発現系の構築を行った。これら酵母の発現誘導を種々検討したが、目的のプロトスタジエノールの酸化産物の検出は認められなかった。次に各P450とCPR遺伝子を大腸菌の系で発現させるべく、pET21aベクターに組み込み、大腸菌BL21(DE3)codonplus株を形質転換した。誘導条件を種々検討し、各々の最適条件にて発現誘導を行い、目的タンパク質の可溶性画分への誘導に成功した。さらに、トリテルペンの構造多様性の生成要因を探索するべく、トリテルペン合成酵素の生成物特異性を決定するアミノ酸残基の同定も行った。
Research Progress Status	24年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	24年度が最終年度であるため、記入しない。