分割ＲｌｕｃーＶｅｎｕｓを用いたシナプス形成・消失のリアルタイムイメージング

• Project Area: Mutli-dimensional fluorescence live imaging of cellular function and molecular activity
• Project/Area Number: 23113501
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥11,050,000 (Direct Cost: ¥8,500,000、Indirect Cost: ¥2,550,000); Fiscal Year 2012: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2011: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
• Keywords: 生物発光 / バイオイメージング

Outline of Annual Research Achievements

シナプス結合を可視化するための技術としてGFP Reconstruction Across Synaptic Partners (GRASP)が開発されたが、GRASPは時間分解能と可逆性に問題がありリアルタイムにシナプスの結合解離を観察するには不向きであった。これらの問題点を解決するために我々はGRASPにおけるGFPを化学発光タンパク質であるウミシイタケルシフェラーゼ(Renilla Luciferase; RLuc)に置き換える事を着想した。RLucはGFPと異なり再構築に要する時間が短く分割・再構築が可逆的である事がわかっている。しかしながらRLucの発光量子収率は約0.05と非常に低く単純にGFPをRLucに置き換えるだけでは細胞・個体のイメージングは難しいと考えられた。そこで我々は生物発光エネルギー移動（Bioluminescence resonance energy transfer; BRET）を利用しRLucの発光量子収率の増強を組み合わせる事をまず試みた。BRETは励起状態にある発光タンパク質-基質複合体(ドナー)から蛍光分子(アクセプター)に無放射的にエネルギーが移動しアクセプターが蛍光を発する現象である。この結果RLucの10倍以上明るい化学発光タンパク質Nano-lanternを開発することに成功した。Nano-lanternのRLucドメイン内の特定の位置にカルシウムイオン, cAMP, ATP感受性タンパク質を挿入する事でカルシウムイオン, cAMP, ATPそれぞれに対する機能性指示薬を開発した(Saito et al, Nat. Commun., 2012)。次に我々はこれら指示薬作成に使ったRLucドメイン内の挿入位置でNano-lanternを分割し上記のGRASP技術への適用を進めている。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging (2012)
  • Author(s): Saito K, Chang YF, Horikawa K, Hatsugai N, Higuchi Y, Hashida M, Yoshida Y, Matsuda T, Arai Y, Nagai T
  • Journal Title: Nature communication Volume: 3 Issue: 1 Pages: 1262-1262
  • DOI: 10.1038/ncomms2248
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 明るい自動発光タンパク質を用いたバイオイメージング (2011)
  • Author(s): 齊藤健太
  • Organizer: 第２０回日本バイオイメージング学会学術集会
  • Place of Presentation: 千歳科学技術大学本部棟