聴・平衡覚器官のイメージング解析～１分子から個体レベルまで～

• Project Area: Mutli-dimensional fluorescence live imaging of cellular function and molecular activity
• Project/Area Number: 23113511
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 齋藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥11,440,000 (Direct Cost: ¥8,800,000、Indirect Cost: ¥2,640,000); Fiscal Year 2012: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000); Fiscal Year 2011: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
• Keywords: 内耳 / イメージング / 難聴 / cdc42 / 聴覚 / 平衡覚

Outline of Annual Research Achievements

驚くほど多数の老人性難聴の患者が存在するにもかかわらず、内耳の機能異常・病態の研究は、内耳が微細な構造体であることから、十分に進んでいない。本研究では、内耳特異的KOマウスを用いて、イメージング手法（個体～1分子）を駆使することにより、内耳疾患の新規治療法の開発に繋がるような新しい研究法を確立しようというものである。
本年度は進行性の高度難聴（80 dB）を呈する内耳有毛細胞特異的Cdc42ノックアウト（KO)マウスを作製し、難聴発症機序の解明を試みた。Cdc42 KO聴覚有毛細胞の電子顕微鏡解析では、聴毛の欠落・癒合が認められた。蝸牛の有毛細胞ではGFP-Cdc42は、聴毛を覆う形質膜と頂側に近い側壁に局在した。聴覚有毛細胞のモデル細胞として用いたMDCK細胞では、1) GFP-Cdc42はcyst管腔に面する頂側面と頂側に近い側壁に局在し、2) Cdc42-ノックダウン（KD）安定細胞株では、微絨毛の減少や癒合とTight junction (TJ) のマーカーであるZO1の細胞内停留が認められた。2) TJの形態異常はKOマウスの聴覚有毛細胞（電顕）でも確認できた。Cdc42 FRET biosensor TG miceの聴覚有毛細胞を用いた二光子蛍光顕微鏡観察では、Cdc42は、聴毛膜の先端部で強い、頂側に近い側壁で弱い活性化を示した。Cdc42-KD細胞株における細胞内シグナルに関しては、CofilinとMyosin phosphatase 1 (MYPT1) のリン酸化亢進に代表されるアクチン代謝障害と代償経路の活性化 (RhoA→ROCK→ LIMK2→Cofilin, RhoA→ROCK→MYPT1→MLC) が観察された。
以上より、Cdc42 KOマウスの進行性難聴は、聴覚有毛細胞内の聴毛及びTJでのアクチン代謝障害に起因することを明らかにした。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Both C1B domain and pseudosubstrate region are necessary for saturated fatty acid membrane;distinct role of intramolecular domains for different (2013)
  • Author(s): Takaaki Nishimoto, T., Kashiwagi, K., Saito, N., and Shirai, Y.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 432 Issue: 2 Pages: 384-388
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.01.048
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel PKC#61537;-mediated phosphorylation site(s) on cofilin and their potential role in terminating histamine release" (2012)
  • Author(s): Sakuma, M., Shirai, Y., Yoshino, K^I., Kuramasu, M., Nakamura, T., Yanagita, T., Mizuno, K., Hide, I., Nakata, Y., Saito, N.
  • Journal Title: Mol Biol. Cell Volume: 23 Pages: 3707-3721
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] MARCKS dephosphorylation is involved in bradykinin-induced neurite outgrowth in neuroblastoma SH-SY5Y cells. (2012)
  • Author(s): Tanabe A, Shiraishi M, Negishi M, Saito N, Tanabe M, and Sasaki Y.
  • Journal Title: J Cell Physiol. Volume: 227 Issue: 2 Pages: 618-629
  • DOI: 10.1002/jcp.22763
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] c-Abl tyros ine kinase regulates serum-induced nuclear export of diacylglycerol kinase α by phosphorylation at Tyr218 (2012)
  • Author(s): Matsubara T, Ikeda M, Kiso Y, Sakuma M, Yoshino K-I, Sakane F, Merida I, Saito N, Shirai Y
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 287 Pages: 5507-5517
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of a novel fluorescence-based method to evaluate chaperone-mediate autophagy in a singlz neuron (2011)
  • Author(s): Seki, T., Ki Y., Tanaka, S., Dohi, E., Onji, T., Yamamoto, K., Seki T, Yoshino KI, Tanaka S, Dohi E, Onji T, Yamamoto K, Hide, I., Sakai, N. et al.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 7 Issue: 2 Pages: e31232-e31232
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0031232
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] c-Abl tyrosine kinase regulates serum-induced nuclear export of diacylglycerol kinase α by phosphorylation at Tyr218 (2011)
  • Author(s): Matsubara, M., Ikeda, M., Kiso, Y., Sakuma, M., Sakane, F., Merida, I, Saito, N., Shirai, Y.
  • Journal Title: J.Biol.Chem Volume: 287 Issue: 8 Pages: 5507-5517
  • DOI: 10.1074/jbc.m111.296897
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cooperation of p40phox with p47phox for Nox2 activation during FcgR-mediated phagocytosis--Mechanism for acquisition of p40phox PI(3)P binding-- (2011)
  • Author(s): Ueyama T, Nakakita J, Nakamura T, Kobayashi T, Kobayashi T, Son J-h, Sakuma M, Sakaguchi H, Leto T, Saito N
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 286 Pages: 40693-40705
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Direct binding of RalA to PKCh and its crucial role in morphological change during keratinocytes differentiation (2011)
  • Author(s): Shirai Y, Morioka S, Sakuma M, Yoshino K, Otsuji C, Sakai N, Kashiwagi K, Chida K, Shirakawa R, Horiuchi H, Nishigori C, Ueyama T, Saito N
  • Journal Title: Mol.Biol.Cell Volume: 22 Pages: 1340-1352
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nuclear Choline Acetyltransferase Activates Transcription of a High-affinity Choline Transporter (2011)
  • Author(s): Matsuo, A., Bellier, J-P, Nishimura, M., Yasuhara, O., Saito, N., Kimura, H.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 286 Pages: 5836-5845
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 黒質線条体系におけるPKC#61543;の基質の解析：ドパミン遊離における#61538;PIXリン酸化の (2013)
  • Author(s): 白藤 俊彦、上山 健彦、吉野 健一、足立 直子、高橋 英之、吾郷 由希夫、
  • Organizer: 第86回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2013-03-21
• [Presentation] Duoxの活性酸素産生機構 (2013)
  • Author(s): 佐久間 恵、上山 健彦、濵田 猛、齋藤 尚亮
  • Organizer: 第86回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2013-03-21
• [Presentation] Role of PKCalpha-mediated cofilin phosphorylation in the degranulation from (2012)
  • Author(s): Sakuma, M., Shirai, Y., Yoshino, K., Kuramasu, M., Nakamura, T., Mizuno, K.,
  • Organizer: 22th IUBMB 37th FEBS
  • Place of Presentation: Madrid
  • Year and Date: 2012-09-04
• [Presentation] Glial functions of Rho-family small GTPases during cerebellar development and (2012)
  • Author(s): Ueyama,T., Kondoh T., Kohta M., Kohmura,E., Hayashibe,M., Nakamura,T.,
  • Organizer: 14th International congress of histochemistry and cytochemistry
  • Place of Presentation: Kyoto
  • Year and Date: 2012-08-26
• [Presentation] Involvment of PKCgamma in neurodegenerative disease (2012)
  • Author(s): Saito, N., Takahashi, H., Shirafuji, T., Adachi, N., Danno, S., Ueyama, T.,
  • Organizer: 14th International congress of histochemistry and cytochemistry
  • Place of Presentation: Kyoto
  • Year and Date: 2012-08-26
• [Presentation] 細胞内シグナル分子の可視化と細胞機能 (2012)
  • Author(s): 齋藤尚亮
  • Organizer: 第89回日本生理学大会
  • Place of Presentation: 松本