挿入的クロマチン免疫沈降法によるエピジェネティック制御機構の解明

• Project Area: The physicochemical field for genetic activities
• Project/Area Number: 23114707
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤井 穂高 大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (30302665)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000); Fiscal Year 2012: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2011: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
• Keywords: クロマチン / 挿入的クロマチン免疫沈降法 / iChIP / 転写調節 / Pax5 / エピジェネティクス / iChIP法 / インスレーター / B細胞分化 / 遺伝子座特異的生化学的エピジェネティクス

Outline of Annual Research Achievements

特定ゲノム領域を単離して生化学的解析を行うための新規方法論である挿入的クロマチン免疫沈降法 (insertional chromatin immunoprecipitation: iChIP) を開発した。本研究班の支援を受けて、まず、ゲノム上の異なった領域間の「しきり」として、エンハンサー遮断機能及び位置効果抑制能を持つインスレーターに結合する新規蛋白質及びRNAの同定に成功した。さらに、iChIP法の最適化に取り組み、第二世代のタグ付きLexA蛋白質3xFNLDDを開発した。また、B細胞分化誘導とその維持に重要な役割を果たしているPax5転写因子遺伝子の発現調節に関わる制御領域・結合RNA・結合蛋白質の網羅的同定とその機能解析を行った。具体的には、ニワトリのB細胞株DT40細胞のPax5遺伝子の転写開始点近傍にLexAの認識配列を挿入した細胞を樹立した。この細胞に、3xFNLDDを発現した。この細胞 (3xFNLDD: LexA-Pax5 (B)) でのPax5蛋白・mRNAの発現は野生型DT40細胞と同等であり、この細胞を用いて、iChIP法により、Pax5遺伝子転写開始点近傍と相互作用している蛋白質・ゲノム領域・RNAを同定した。このうち、Pax5遺伝子転写開始点近傍と相互作用しているある核内蛋白質の発現がB細胞特異的であり、この蛋白質の発現を低下させるとPax5の発現が低下することを示し、この蛋白質がPax5遺伝子発現調節に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、iChIP-Seq解析の結果から、Pax5遺伝子転写開始点近傍が、多数の染色体内・染色体間相互作用をしていることを明らかにした。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation (2013)
  • Author(s): Toshitsugu Fujita
  • Journal Title: ISRN Biochem. Volume: 2013 Pages: 913273-913273
  • DOI: 10.1155/2013/913273
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transcription start sites and usage of the first exon of mouse Foxp3 gene (2012)
  • Author(s): Toshitsugu Fujita
  • Journal Title: Mol. Biol. Rep. Volume: 39 Issue: 10 Pages: 9613-9619
  • DOI: 10.1007/s11033-012-1825-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain (2012)
  • Author(s): Toshitsugu Fujita
  • Journal Title: Adv. Biosci. Biotechnol. Volume: 3 Issue: 05 Pages: 626-629
  • DOI: 10.4236/abb.2012.35081
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Apurinic/apyrimidinic endonuclease1/redox factor-1 (Ape1/Ref-1) is essential for IL-21-induced signal transduction through ERK1/2 pathway (2012)
  • Author(s): Juliana FM, Nara H, Onoda T, Rahman M, Araki A, Jin L, Fujii H, Tanaka N, Hoshino T and Asao H
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res.Commun Volume: 420 Issue: 3 Pages: 628-634
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.03.051
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Direct identification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation (2011)
  • Author(s): Fujita, T. and Fujii, H
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 6 Issue: 10 Pages: e26109-e26109
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0026109
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Locus-specific biochemical epigenetics by insertional chromatinimmunoprecipitation (iChIP) (2013)
  • Author(s): Hodaka Fujii
  • Organizer: Epigenetics Chromatin: Interactions and processes
  • Place of Presentation: Boston, USA
  • Year and Date: 2013-03-11
• [Presentation] Locus-specific biochemical epigenetics by insertional chromatinimmunoprecipitation (iChIP) (2012)
  • Author(s): Hodaka Fujii
  • Organizer: Cold Spring Harbor Meeting "Epigenetics Chromatin"
  • Place of Presentation: Cold Spring Harbor, USA
  • Year and Date: 2012-09-11
• [Presentation] 挿入的クロマチン免疫沈降法（iChIP法）による遺伝子座特異的生化学的エピジェネティクス (2012)
  • Author(s): 藤田敏次
  • Organizer: 第6回日本エピジェネティクス研究会年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2012-05-14
• [Presentation] Locus-specific biochemical epigenetics by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) (2012)
  • Author(s): Hodaka Fujii
  • Organizer: Gordon Research Conference "Chromatin Structure Function"
  • Place of Presentation: Lucca, Italy
  • Year and Date: 2012-05-06
• [Presentation] Direct identification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) (2012)
  • Author(s): Hodaka Fujii
  • Organizer: Keystone Symposium "Epigenomics"
  • Place of Presentation: Keystone Resort, Keystone, Colorado, USA
  • Year and Date: 2012-01-18
• [Presentation] 挿入的クロマチン免疫沈降法を利用したインスレーター分子の同定 (2011)
  • Author(s): 藤田敏次
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • Year and Date: 2011-12-16
• [Presentation] 挿入的クロマチン免疫沈降法(iChIP)による特定ゲノム領域エピジェネティクス制御機構の生化学的解析 (2011)
  • Author(s): 藤井穂高
  • Organizer: 日本エピジェネティクス研究会第5回年会
  • Place of Presentation: KKRホテル熊本(熊本県)
  • Year and Date: 2011-05-20
• [Remarks] 藤井研究室ホームページ
  • URL: http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/index.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/index.html
• [Patent(Industrial Property Rights)] 内在性DNA 配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 (2013)
  • Inventor(s): 藤井 穂高、藤田 敏次
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人大阪大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2013-026310
  • Filing Date: 2013-02-14