病態モデル細胞を用いたシグナル伝達破綻メカニズムの解明

• Project Area: Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation
• Project/Area Number: 23117509
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 加納 ふみ 東京大学, 総合文化研究科, 助教 (10361594)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000); Fiscal Year 2012: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2011: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
• Keywords: 病態モデル細胞 / セミインタクト細胞 / リシール細胞 / シグナル伝達 / エンドサイトーシス / p38 MAPキナーゼ

Research Abstract

本研究では、セミインタクト細胞リシール法（可逆的形質膜穿孔法）を駆使して病態モデル細胞を構築し、病態環境下におけるシグナル伝達の攪乱機構を解明することを目的とする。糖尿病モデルマウスdb/dbマウス肝臓の細胞質をセミインタクト細胞リシール法により導入した糖尿病モデルH4IIEC（ラット肝臓由来培養細胞）細胞を構築した。この糖尿病モデル肝細胞が病態を再現しているかどうか、インスリン応答性シグナル伝達を調べることにより検証した。インスリン刺激により誘起されるAktあるいはERKのリン酸化を指標として各シグナル伝達経路の活性化をWestern Blotにより調べたところ、興味深いことに糖尿病モデル肝細胞ではAktのリン酸化が特異的に阻害されていた。また、Aktシグナル伝達のダイナミクスを追跡するために、FRETベースのAktリン酸化可視化プローブEeveeのリコンビナントタンパク質を細胞質とともにリシール細胞に導入した。すると予想通り、糖尿病モデル肝細胞ではAktの活性化ダイナミクスが攪乱されていた。また、これまで発表した論文から、糖尿病細胞質存在下においては脂質ホスファチジルイノシトール-3-リン酸(PI3P)が減少をしていることを見いだしている。そこで、PI3P減少とAktシグナル伝達阻害との関連を検証するために、PI3P結合FYVEドメインのGST融合リコンビナントタンパク質（GST-2xFYVE）を細胞内に大量に導入しAktシグナル伝達への影響を調べた。すると、GST-2xFYVEはAktシグナル伝達を阻害することをWestern blotおよびダイナミクス可視化により確認することができた。以上の結果から、シグナル伝達阻害が再現された糖尿病モデル肝細胞を用い、細胞レベルでの病態関連因子解明の一例としてPI3P減少があることを示すことができた。

Current Status of Research Progress

Reason

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The Semi-Intact Cell System and Methods for Cell Resealing: a Novel Systems Biology Tool to Elucidate Protein Networks with Spatio-Templioral Information (2013)
  • Author(s): Kano, F., Murata, M.
  • Journal Title: Advances in Systems Biology Volume: 2 Pages: 6-14
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PPARγ-induced PARylation promotes local DNA demethylation by production of 5-hydroxymethylcytosine (2013)
  • Author(s): Katsunori Fujiki, Akihiro Shinoda, Fumi Kano, Ryuichiro Sato, Katsuhiko Shirahige & Masayuki Murata
  • Journal Title: Nature Co㎜unications Volume: 4 Issue: 1 Pages: 2-262
  • DOI: 10.1038/ncomms3262
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Resealed-Cell System for Analyzing Pathogenic Intracellular Events : Perturbation of Endocytic Pathways under Diabetic Conditions. (2012)
  • Author(s): Fumi Kano, et al.
  • Journal Title: PLoS ONE. Volume: 7 Issue: 8 Pages: e44127-e44127
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0044127
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Semi-intact cell system : Application to the nalysis of membrane trafficking beween the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus and of cell cycle-dependent changes in the morphology of these organelles. (2012)
  • Author(s): Masayuki Murata, et al.
  • Journal Title: Crosstalk and Integration of Membrane Trafficking Pathways. (Weigert, R. ed.)
  • DOI: 10.5772/31440
  • ISBN: 9789535105152
• [Journal Article] Hydrogen peroxide depletes phosphatidylinositol-3-phosphate from endosomes in a p38MAPK-dependent manner and perturbs end ocytic transports and signal transduction in pathogenic cells. (2012)
  • Author(s): Masayuki Murata, et al.
  • Journal Title: Hydrogen Peroxide : Detection, Application an d Health Implications. (G. Aguilar and R. A. Guzman ed.)
• [Journal Article] PKCd and e regulate the morphological integrity of the ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC) but not the anterograde and retrograde transports via the Golgi apparatus. (2012)
  • Author(s): Taichi Sugawara, et al.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Acta (Molecular Cell Rese arch) Volume: 1823 Pages: 861-875
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A new vesicular scaffoldig complex mediates the G-protein coupled 5-HT1A receptor targeting to neuronal dendrites (2012)
  • Author(s): Al Awabdh S, et al.
  • Journal Title: J. Neurosci. Volume: 32 Pages: 14227-14241
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] セミインタクト細胞リシール技術を用いた病態モデル細胞創成とその細胞工学的応用 (2012)
  • Author(s): 加納ふみ、他
  • Journal Title: 細胞工学 Volume: 31 Pages: 1376-1382
• [Journal Article] 新しい機能を問われ出した小胞体-ゴルジ体中間区画(ER-Golgi intermediate compartment : ERGIC) (2012)
  • Author(s): 菅原太一、他
  • Journal Title: 生体の科学 Volume: 63 Pages: 424-425
• [Journal Article] 哺乳動物細胞ゴルジ体の細胞周期依存的ディスアッセンブリー (2012)
  • Author(s): 加納ふみ、他
  • Journal Title: 生体の科学 Volume: 63 Pages: 404-407
• [Journal Article] セミインタクト細胞リシール法を用いた「病態モデル細胞」作製とその疾患研究への応用 (2012)
  • Author(s): 村田昌之、他
  • Journal Title: 化学と生物 Volume: 50 Pages: 510-517
• [Presentation] セミインタクト細胞リシール法を用いた病態モデル細胞の創成 (2013)
  • Author(s): 加納ふみ、村田昌之
  • Organizer: 第６５回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知県）
  • Invited
• [Presentation] セミインタクト細胞リシール技術を用いた糖尿病モデル細胞の構築：病態依存的なエンドサイトーシス攪乱 (2013)
  • Author(s): 堀内雄太、加納ふみ、野口誉之、村田昌之
  • Organizer: 第６５回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知県）
• [Presentation] Disease model cell system: a novel proteomics tool to elucidate protein networks with spatio-temporal information (2013)
  • Author(s): Fumi Kano, Daiki Nakatsu, Yoshiyuki Noguchi, Yuta Horiuchi, Masayuki Murata
  • Organizer: The 12th Human Proteome Organization Congress
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県）
• [Presentation] セミインタクト細胞リシール技術を用いた糖尿病モデル細胞の構築 (2013)
  • Author(s): 野口 誉之, 堀内 雄太, 中津 大貴, 加納 ふみ, 村田 昌之
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府）
• [Presentation] A Resealed-Cell System for Analyzing Pathogenic Intracellular Events : Insight into Signal Transduction Cascade in Hyperlipidemic or Diabetic Cells. (2012)
  • Author(s): Masayuki Murata, et al.
  • Organizer: The 25th Annual and International Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology (JAACT2012)
  • Place of Presentation: Nagoya Congress Center, Nagoya, Japan
  • Year and Date: 2012-11-27