蛋白質リン酸化修飾イメージングの超高感度化とオミクス技術への展開

• Project Area: Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation
• Project/Area Number: 23117522
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 木下 英司 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 准教授 (80304418)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2012: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2011: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: フォスタグ / 翻訳後修飾 / リン酸化 / シグナル伝達 / プロテオーム / キナーゼ / ホスファターゼ / 抗体 / ペプチドアレイ

Outline of Annual Research Achievements

近年，蛋白質リン酸化反応の検出技術は，癌などの分子標的薬のスクリーニング法として注目を集めている。よって，生体内のごく僅かな蛋白質リン酸化反応を網羅的にプロファイルできる，より特異的で，かつ，超高感度な分析技法の開発が急務である。申請者はリン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体（フォスタグ）に１分子のビオチンを導入したリン酸基認識素子を既に開発している。本研究では，これを改変させることで，既存の機器や発光試薬を改良することなく検出感度を飛躍的に高めることを目指す。当該年度では，昨年度合成に成功した新規ビオチン結合型誘導体（BTL-111，ビオチンとフォスタグ分子間に12分子のエチレングルコールを導入した誘導体）を使用したリン酸化プロテオミクスのための新しいアプリケーションを開発した。以下に研究の成果を列記する。１）抗体アレイ技術を用いたマルチプレックスなリン酸化蛋白質の検出法，２）BioPlex 技術を用いたマルチプレックスなリン酸化シグナルの同定法。この２つのアプリケーションは抗体とフォスタグを用いた蛋白質リン酸化反応のサンドイッチアッセイ法の１つとして位置づけられる。本手法の大きな利点は，抗リン酸化蛋白質抗体が作製されていないような蛋白質のリン酸化を検出できる，複数の蛋白質リン酸化を一度に検出することができる，フォスタグによる検出は蛋白質分子全体のリン酸化反応を検出できるので，部位特異的な抗リン酸化蛋白質抗体と併用することにより多くの情報を入手することができる，などが挙げられる。今後，本法が次世代のシグナル伝達研究に大きく貢献することを期待する。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] A Phos-tag-based magnetic-bead method for rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules (2013)
  • Author(s): M. Tsunehiro, Y. Meki, K. Matsuoka, E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita and T. Koike
  • Journal Title: Journal of Chromatography B Volume: 925 Pages: 86-94
  • DOI: 10.1016/j.jchromb.2013.02.039
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sandwich assay for phosphorylation of protein multiplexes by using antibodies and Phos-tag (2013)
  • Author(s): E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike
  • Journal Title: Analytical Biochemistry Volume: 438 Issue: 2 Pages: 104-106
  • DOI: 10.1016/j.ab.2013.03.029
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Highly sensitive detection of protein phosphorylation by using improved Phos-tag Biotin (2012)
  • Author(s): E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, Y. Sugiyama, Y. Fukada, T. Ozeki, and T. Koike
  • Journal Title: Proteomics Volume: 12 Issue: 7 Pages: 932-937
  • DOI: 10.1002/pmic.201100639
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein phosphorylation in encystment-induced Colpoda cucullus: localization and identification of phosphoproteins. (2012)
  • Author(s): Sogame, Y.
  • Journal Title: FEMS Microbiol. Lett. Volume: 331 Issue: 2 Pages: 128-135
  • DOI: 10.1111/j.1574-6968.2012.02560.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] EF-1α and mitochondrial ATP synthase ・ chain: Alteration of their expression in encystment-induced Colpoda cucullus (2012)
  • Author(s): Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T.,Eiji Kinoshita, and Matsuoka, T
  • Journal Title: J. Eukaryot. Microbiol Volume: 59 Issue: 4 Pages: 401-406
  • DOI: 10.1111/j.1550-7408.2012.00628.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Laborsaving, Timesaving, and More Reliable Strategy for Separation of Low-Molecular-Mass Phosphoproteins in Phos-tag Affinity Electrophoresis (2012)
  • Author(s): E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike
  • Journal Title: International Journal of Chemistry Volume: 4 Issue: 5 Pages: 1-8
  • DOI: 10.5539/ijc.v4n5p1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phos-tag SDS-PAGE systems for phosphorylation profiling of proteins with a wide range of molecular masses under neutral pH conditions (2012)
  • Author(s): E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike
  • Journal Title: Proteomics Volume: 12 Issue: 2 Pages: 192-202
  • DOI: 10.1002/pmic.201100524
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] フォスタグケミストリー (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Journal Title: 生物物理化学 Volume: 56
  • NAID: 130004809452
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 今後の展望1中性条件で泳動を行う改良型Phos-tag SDS-PAGEを用いたリン酸化タンパク質解析 (2012)
  • Author(s): 木下恵美子
  • Journal Title: 生物物理化学 Volume: 56
  • NAID: 130004809455
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 今後の展望2蛍光性Phos-tagを用いたタンパク質リン酸化反応の解析法 (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Journal Title: 生物物理化学 Volume: 56
  • NAID: 130004809456
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] プロトコール集フォスタグテクノロジーを用いたリン酸化タンパク質解析法 (2012)
  • Author(s): 木下恵美子
  • Journal Title: 生物物理化学 Volume: 56
  • NAID: 130004809457
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Separation and identification of four distinct serine-phosphorylation states of ovalbumin by Phos-tag affinity electrophoresis (2012)
  • Author(s): E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike
  • Journal Title: Electrophoresis Volume: 33 Issue: 5 Pages: 849-855
  • DOI: 10.1002/elps.201100518
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Phos-tag-based fluorescence resonance energy transfer system for the analysis of the kinase reaction of a substrate peptide (2011)
  • Author(s): M. Somura, K. Takiyama, E. Kinoshita- Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike
  • Journal Title: Analytical Methods Volume: 3 Issue: 6 Pages: 1303-1309
  • DOI: 10.1039/c1ay05016h
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ca2+-dependent in vivo protein phosphorylation and encystment induction in the ciliated protozoan Colpoda cucullus (2011)
  • Author(s): Sogame, Y., Eiji Kinoshita, and Matsuoka, T
  • Journal Title: Eur. J. Protistol Volume: 4 7 Issue: 3 Pages: 208-213
  • DOI: 10.1016/j.ejop.2011.02.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Possible involvement of cAMP and protein phosphorylation in the cell signaling pathway for resting cyst formation of ciliated protozoan Colpoda cucullus (2011)
  • Author(s): Sogame, Y.
  • Journal Title: Acta Protozool. Volume: 50 Pages: 71-79
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Highly sensitive imaging of protein phosphorylation by Phos-tag technology (2013)
  • Author(s): Kinoshita, E.
  • Organizer: 1st International Symposium on Protein Modifications in Pathogenic Dysregulation of Signaling
  • Place of Presentation: 東大医科研講堂，東京
  • Year and Date: 2013-02-01
• [Presentation] Phos-tag 技術が拓くタンパク質リン酸化研究の新たな潮流 (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第85回日本生化学会大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場，福岡
  • Year and Date: 2012-12-16
• [Presentation] SuperSep Phos-tag プレキャストゲル：迅速，高効率，かつ，高精度なリン酸化シグナル伝達分子の分離検出法 (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: マリンメッセ福岡，福岡
  • Year and Date: 2012-12-11
• [Presentation] Phos-tag技術によって新たにできるようになったこと (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 新薬理学セミナー 2012
  • Place of Presentation: 熊本大学薬学部宮本記念館，熊本市
  • Year and Date: 2012-11-24
  • Invited
• [Presentation] Phos-tag SDS-PAGE systems for protein phosphorylation profiling under neutral pH conditions (2012)
  • Author(s): Kinoshita, E.
  • Organizer: HUPO 11th Annual World Congress
  • Place of Presentation: Hynes Convention Center, Boston, MI, USA
  • Year and Date: 2012-09-09
• [Presentation] リン酸化タンパク質解析のためのフォスタグテクノロジー (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第63回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター，宜野湾
  • Year and Date: 2012-08-20
• [Presentation] 改良型Phos-tag Biotinの開発とリン酸化プロテオミクスへの応用 (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2012年大会
  • Place of Presentation: 日本科学未来館，東京
  • Year and Date: 2012-07-26
• [Presentation] Phos-tagアフィニティ電気泳動の開発と改良～リン酸化タンパク質の分析 (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第62回日本電気泳動学会シンポジウム
  • Place of Presentation: 慶応義塾大学薬学部，東京
  • Year and Date: 2012-05-11
• [Presentation] リン酸化生体分子解析のためのPhos-tagテクノロジー (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第610回九州大学生医研セミナー
  • Place of Presentation: 博多市(招待講演)
  • Year and Date: 2012-02-23
• [Presentation] Phos-tagがもたらす蛋白質リン酸化解析のブレークスルー (2011)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 横浜市(招待講演)
  • Year and Date: 2011-12-13
• [Presentation] Phos-tag親和電気泳動法の開発 (2011)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第62回日本電気泳動学会(第50回児玉賞受賞講演)
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2011-11-12
• [Presentation] 改良型Phos-tag Biotinの開発とその応用 (2011)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第62回日本電気泳動学会
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2011-11-12
• [Presentation] Phos-tagによるタンパク質リン酸化修飾の高感度検出 (2011)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: QCM研究会
  • Place of Presentation: 東京都千代田区(招待講演)
  • Year and Date: 2011-10-14
• [Presentation] リン酸化プロテオミクスに向けたPhos-tagテクノロジーの奥義 (2011)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第63回日本生物工学会
  • Place of Presentation: 東京都小金井市(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-28
• [Presentation] Phos-tagを用いた分子イメージングとリン酸化シグナル研究 (2011)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 京都市
  • Year and Date: 2011-09-24
• [Presentation] 改良型Phos-tag Biotinを用いたペプチドマイクロアレイ解析による蛋白質リン酸化反応プロファイリング (2011)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第9回日本プロテオーム学会
  • Place of Presentation: 新潟市
  • Year and Date: 2011-07-29
• [Book] Phos-tag affinity electrophoresis for protein kinase profiling. (2012)
  • Author(s): Kinoshita, E.
  • Total Pages: 22
  • Publisher: Springer
• [Book] 臨床プロテオミクス～バイオマーカー探索から個別化医療へ (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 金原出版
• [Book] DNA Replication and Mutation (2012)
  • Author(s): Kinoshita, E.
  • Total Pages: 21
  • Publisher: Nova Science Publishers
• [Book] 実験医学増刊号,羊土社 (2012)
  • Author(s): 木下英司
  • Total Pages: 7
  • Publisher: リン酸基アフィニティ電気泳動法(Phos-tag SDS-PAGE)を用いたタンパク質リン酸化修飾の高感度検出
• [Book] DNA Replication and Mutation, Nova Science Publishers (2011)
  • Author(s): Kinoshita, E.
  • Total Pages: 22
  • Publisher: Gel-Based Methods using DNA-Binding Zinc(II) Complexes for the Detection of DNA Mutations
• [Remarks]
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.phos-tag.com/