無細胞蛋白質アレイを基盤とした細胞がん化Ｅ３リガーゼの網羅的同定と解析

• Project Area: Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation
• Project/Area Number: 23117524
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 澤崎 達也 愛媛大学, 無細胞生命科学工学研究センター, 教授 (50314969)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥12,480,000 (Direct Cost: ¥9,600,000、Indirect Cost: ¥2,880,000); Fiscal Year 2012: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2011: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
• Keywords: E3リガーゼ / 無細胞タンパク質合成 / がん抑制タンパク質 / ユビキチン化 / RING / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / p53

Outline of Annual Research Achievements

III．アルファスクリーン法によるユビキチン化E3リガーゼの同定および生化学的解析
１）ユビキチン化E3リガーゼの同定：アルファスクリーン法を基盤する申請者らが開発してきた手法を用いて、目的蛋白質タンパク質のユビキチン化反応を検出した。2）新規E3リガーゼによるユビキチン化部位の同定および抗体作成：in vitro系でユビキチン化された基質タンパク質を精製タグで回収後、質量分析によりユビキチン化部位の同定を行った。

IV．細胞がん化における新規分子の細胞生物学的解析
１）共発現による細胞内ユビキチン化確認および細胞内解析：上記で同定されたE3リガーゼ分子のcDNAを基に動物細胞発現用ベクターを構築し、新規分子の細胞内でのユビキチン化および分解促進を確認した。また、ユビキチン化部位の同定、細胞内局在やプロテアソーム阻害剤処理での影響も確認した。2）新規分子の発現抑制におけるがん化維持への影響：抗体を用いて、がん細胞株での新規分子のタンパク質レベルでの発現を確認し、高発現分子にはおいては、siRNAでの発現抑制を行い、増殖や細胞分裂への影響を確認した。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] In vivo imaging of hierarchical spatiotemporal activation of caspase-8 during apoptosis. (2012)
  • Author(s): Kominami K., et al.,
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 7 Issue: 11 Pages: 1-18
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0050218
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of a robust dengue virus NS3-NS5 binding assay for identification of protein-protein interaction inhibitors. (2012)
  • Author(s): Takahashi H., et al.,
  • Journal Title: Antiviral Res. Volume: 96 Issue: 3 Pages: 305-314
  • DOI: 10.1016/j.antiviral.2012.09.023
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interferon-induced SCYL2 limits release of HIV-1 by triggering PP2A-mediated dephosphorylation of the viral protein Vpu. (2012)
  • Author(s): Miyakawa K., et al.,
  • Journal Title: Sci Signal. Volume: 5 Issue: 245
  • DOI: 10.1126/scisignal.2003212
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome-wide biochemical analysis of Arabidopsis protein phosphatase using a wheat cell-free system. (2012)
  • Author(s): Takahashi H., et al.,
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 586 Issue: 19 Pages: 3134-3141
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2012.08.014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stress-inducible caspase substrate TRB3 promotes nuclear translocation of procaspase-3. (2012)
  • Author(s): Shimizu K., et al.,
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 7 Issue: 8 Pages: e42721-e42721
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0042721
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The molecular mechanism of apoptosis upon caspase-8 activation: quantitative experimental validation of a mathematical model. (2012)
  • Author(s): Kominami K., et al.,
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta. Volume: 1823 Issue: 10 Pages: 1825-1840
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2012.07.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular and enzymatic characterization of XMRV protease by a cell-free proteolytic analysis. (2012)
  • Author(s): Matsunaga S
  • Journal Title: J Proteomics Volume: 75 Issue: 15 Pages: 4863-4873
  • DOI: 10.1016/j.jprot.2012.05.047
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel Sec14 phospholipid transfer protein from Nicotiana benthamiana is up-regulated in response to Ralstonia solanacearum infection, pathogen associated molecular patterns and effector molecules and involved in plant immunity. (2012)
  • Author(s): Kiba A., et al.,
  • Journal Title: J Plant Physiol. Volume: 169 Issue: 10 Pages: 1017-1022
  • DOI: 10.1016/j.jplph.2012.04.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Specific in situ visualization of plasma cells producing antibodies against Porphyromonas gingivalis in gingival radicular cyst : application of the enzyme-labeled antigen method (2011)
  • Author(s): Tsuge S, et al
  • Journal Title: J Histochem Cytochem Volume: 59 Pages: 673-689
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Caspase-8 cleavage of the interleukin-21 (IL-21) receptor is a negative feedback regulator of IL-21 signaling (2011)
  • Author(s): Akagi T.
  • Journal Title: FEBS Lett Volume: 585 Pages: 1835-1840
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system (2011)
  • Author(s): Nozawa A., et al
  • Journal Title: BMC Biotechnol Volume: 11 Pages: 35-35
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Autophosphorylation profiling of Arabidopsis protein kinases usmg the cell-free system (2011)
  • Author(s): Nemoto K., et al
  • Journal Title: Phytochemistry Volume: 72 Pages: 1136-1144
  • Peer Reviewed
• [Presentation] シロイヌナズナキナーゼの基質探索技術 (2013)
  • Author(s): 根本 圭一郎ら
  • Organizer: 第５４回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岡山大学 津島キャンパス（岡山市）
  • Year and Date: 2013-03-21
  • Invited
• [Presentation] 無細胞技術を基盤とした蛋白質ライブラリー構築 (2013)
  • Author(s): 竹田 浩之ら
  • Organizer: 第５４回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岡山大学 津島キャンパス（岡山市）
  • Year and Date: 2013-03-21
  • Invited
• [Presentation] Analysis of Caspase-dependent Signaling Mechanism on Myogenic Differentiation. (2012)
  • Author(s): 清水 康平ら
  • Organizer: 2012 ASCB Annual Meeting
  • Place of Presentation: Moscone Center, San Francisco, USA
  • Year and Date: 2012-12-16
• [Presentation] コムギ無細胞系発現抗原を用いた抗GPCRモノクローナル抗体の作製と評価 (2012)
  • Author(s): 小原 賢大ら
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡市）
  • Year and Date: 2012-12-11
• [Presentation] HCV タンパク質と相互作用するE3 リガーゼの網羅的探索 (2012)
  • Author(s): 黒河 健太ら
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡市）
  • Year and Date: 2012-12-11
• [Presentation] コムギ無細胞系を基盤としたLKB １をユビキチン化するE3 リガーゼの探索 (2012)
  • Author(s): 西森 香織ら
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡市）
  • Year and Date: 2012-12-11
• [Presentation] コムギ無細胞系を基盤としたp53 をユビキチン化するE3 リガーゼの同定 (2012)
  • Author(s): 安岡 左起ら
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡市）
  • Year and Date: 2012-12-11
• [Presentation] コムギ無細胞系を用いたCYLD と相互作用するE3 リガーゼの探索 (2012)
  • Author(s): 上松 篤史ら
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡市）
  • Year and Date: 2012-12-11
• [Presentation] Identification and Functional Analysis of Tyrosine Phosphorylationdependent MAP Kinase Cascade (2012)
  • Author(s): 根本圭一郎, ら
  • Organizer: 第53回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 京都国際会議場(京都市)
  • Year and Date: 2012-03-17
• [Presentation] Tyrosine-autophosphorylation protein kinases in Arabidopsis (2011)
  • Author(s): 根本圭一郎, ら
  • Organizer: Plant Genomes & Biotechnology : from Genes to Networks
  • Place of Presentation: Cold Spring Harbor Laboratory, USA
  • Year and Date: 2011-12-03
• [Presentation] Regulation of eEF2K activity in Fas-induced apoptosis (2011)
  • Author(s): 岩崎隆宏, ら
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場(横浜市)
• [Presentation] 無細胞基盤プロテオリポソームを用いた細胞への膜蛋白質導入技術の開発 (2011)
  • Author(s): 高橋守, ら
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場(横浜市)
• [Presentation] カスパーゼ3,6,7により切断されるプロテインキナーゼの比較 (2011)
  • Author(s): 林祥太, ら
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場(横浜市)
• [Presentation] コムギ無細胞系を基盤としたp53をユビキチン化するE3リガーゼの同定 (2011)
  • Author(s): 安岡佐起, ら
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場(横浜市)
• [Presentation] 澤崎達也,遠藤弥重太.コムギ無細胞系発現プロテオリポソームを用いた抗膜タンパク質抗体作製 (2011)
  • Author(s): 竹田浩之, ら
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場(横浜市)
• [Presentation] コムギ無細胞系基盤タンパク質ライブラリーを用いた新規乳がんマーカー探索 (2011)
  • Author(s): 小原賢大, ら
  • Organizer: 第6回無細胞生命科学研究会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学(姫路市)
• [Presentation] コムギ無細胞系発現プロテオリポソームを用いた抗膜タンパク質抗体作製 (2011)
  • Author(s): 竹田浩之, ら
  • Organizer: 第6回無細胞生命科学研究会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学(姫路市)
• [Presentation] CONSTRUCTION OF INFLUENZA VIRUS-LIKE PARTICLES USING A LIPOSOME-SUPPLEMENTED WHEAT CELL-FREE TRANSLATION SYSTEM (2011)
  • Author(s): 室井敦, ら
  • Organizer: IUMS2011
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(札幌
• [Remarks] 澤崎研究室
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/
• [Remarks]
  • URL: http://www.ehime-u.ac.jp/~cellfree/sawasakilab