Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
ABCトランスポーターのATP加水分解とエネルギー変換のメカニズムについて、様々な生化学的手法、結晶学的手法を用いて解析が行われてきたが、その全容は未だ解明されていない。本研究では、ATP加水分解反応メカニズムの解明をめざし研究を推進した。1.FRETによるATP加水分解メカニズムの解析：任意のアミノ酸残基をCys残基に置換したSingle Cysteine変異体を作製した。導入したCys残基をAlexa532で修飾し、ATP有・無の条件下で自作の高感度蛍光分光光度計を用いて蛍光強度の変化を観察し、ATP存在下で優位な蛍光強度の増強が観察された。さらに、AMP-PNP, ATP-γS, ADP-ViなどのATPアナログを用いて、ATP加水分解の各ステップにおける蛍光強度の変化を観察した。その結果、蛍光強度がATPの加水分解の各ステップで変化し、ATPの結合と加水分解により誘発されるABCトランスポーターの構造変化を示していることが明らかとなった。2.一分子蛍光観察装置による解析：Alexa532で修飾したABCトランスポーターを一分子蛍光観察装置に流し、ATP有・無において、一分子蛍光強度の時系列データを取得した。一分子蛍光強度分布から、ATPの添加により50-100 a.u. 程度の強光側へのピークのシフトが観察された。また、LES (Local equilibrium state) 解析から、複数の構造状態が存在することが示唆された。3.昆虫細胞由来無細胞蛋白質合成系を用いた非天然アミノ酸導入による2色導入法の開発：ABCトランスポーターのダイナミックな構造変化の観察には、2色の蛍光色素を導入し2光子間でのFRETの観察が必要である。そこで、昆虫細胞由来の無細胞蛋白質合成系を用いてアンバーコドンと4塩基コドンを用いた非天然アミノ酸導入系による2色導入法を開発した。
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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J. Biochem.
Volume: 印刷中
40020056344
