中性子解析によるＡＴＰ結合タンパク質の水和構造とそのダイナミクス

• Project Area: Water plays a key role in ATP hydrolysis and ATP-driven functions of proteins
• Project/Area Number: 23118704
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 新村 信雄 茨城大学, フロンティア応用原子科学研究センター, 特任教授 (50004453)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2012: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2011: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: 生物物理 / 構造生物 / ＡＴＰ / 水和構造 / 中性子 / ATP結合タンパク質 / ダイナミクス / 中性子解析 / 負エントロピー / DAPK / 結晶育成 / ATPエネルギー変換

Outline of Annual Research Achievements

ATP結合タンパク質のATP結合前後における水和水の配向変化をX線および中性子回折法により原子レベルで観察し、ATPエネルギー変換を“負エントロピー”を産み出す構造変化の切り口から解明することを目的とする。ATP結合タンパク質として、ATP類似物質結合により10数個の水和水構造変化を起こすタンパク質DAPK（Death-associated protein kinase）を取り上げた。DAPKは合成DNAを用いて大腸菌で発現させ、イオン交換樹脂・ゲル濾過カラムクロマトグラフィー精製を行い、75mgの試料を取得した。結晶化剤PEG1000,硫酸アンモニウム、硫酸リチウムで結晶析出することが判明し、DAPK結晶成長相図を作成し、それをもとに結晶育成を行い、最大0.032mm3の結晶を得ることが出来た。それをX線結晶解析実験に用い、DAPK単独およびATP類似物質を結合させた状態でのリガンド結合部位のフーリエ図を解析し、リガンド結合部位付近の水分子数がそれぞれ23個,24個と求められた。中性子回折実験用大型単結晶（1 mm3以上の結晶は現時点では得られず、中性子回折実験は未だ出来ていない。DAPKにATPアナログ分子が結合するとき発生する熱を等温滴定熱量測定装置で行い、結合定数（Kd / M：5.41×10-7）、反応の結合比(n:1)、エンタルピー変化(ΔH / kJmol-1 :-57.3±0.4)、およびエントロピー変化(ΔS0 / JK-1mol-1:-72±1)をそれぞれ取得した。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Hydrogen-bond network and pH sensitivity in transthyretin: Neutron crystal structure of human transthyretin (2012)
  • Author(s): Takeshi Yokoyama
  • Journal Title: Journal of Structural Biology Volume: 177 Pages: 283-290
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] X-ray and neutron protein crystallographic analysis of the trypsin-BPTI complex (2011)
  • Author(s): Kenji Kawamura
  • Journal Title: Acta Cryst Volume: D67 Pages: 140-148
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Current Status and Future Prospect of Neutron Protein Crystallography in Japan (2013)
  • Author(s): Nobuo Niimura
  • Organizer: ESS Symposium
  • Place of Presentation: Aarhus, Denmark
  • Year and Date: 2013-03-21
  • Invited
• [Presentation] ature of Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules (2013)
  • Author(s): 新村信雄
  • Organizer: CBI学会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2013-02-15
  • Invited
• [Presentation] 生命科学と中性子-生命科学と超低速ミュオンに向けて- (2012)
  • Author(s): 新村信雄
  • Organizer: USM preschool
  • Place of Presentation: 北海道大学
  • Year and Date: 2012-08-29
  • Invited
• [Presentation] 微小重力下での中性子回折用大型結晶育成に向けて (2012)
  • Author(s): 新村信雄
  • Organizer: 日本タンパク室科学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2012-06-22
  • Invited
• [Presentation] Protein Crystallization under Micro-gravity for Neutron Diffraction. (2012)
  • Author(s): Nobuo Niimura
  • Organizer: Japan-Russia Joint Workshop on Crystallization under Microgravity
  • Place of Presentation: モスクワ
  • Year and Date: 2012-06-22
  • Invited
• [Presentation] Neutron Protein Crystallography. How to proceed the experiments to obtain the structural information of hydrogen, protons and hydration in Bio-macromolecules (2012)
  • Author(s): Nobuo Niimura
  • Organizer: Erice 2012
  • Place of Presentation: Erice, Sicily
  • Year and Date: 2012-06-08
  • Invited
• [Presentation] Hydrogen- and Hydration-Sensitive Structural Biology (2011)
  • Author(s): Nobuo Niimura
  • Organizer: Neutron Protein Crystallography. AOCNS Keynote Lecture
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(つくば)(Invited)
  • Year and Date: 2011-11-24
• [Presentation] Proton polarization technique for neutron protein crystallography (2011)
  • Author(s): Nobuo Niimura
  • Organizer: 国際結晶学会IUC r
  • Place of Presentation: Palacio Municipal de Congresos(スペイン マドリッド)
  • Year and Date: 2011-08-27
• [Book] Neutron Diffraction (2012)
  • Author(s): Nobuo Niimura
  • Publisher: INTECH
• [Book] The pH dependence of protonation states of polar amino acid residues determined by neutron diffraction. Neutron Diffraction" (2011)
  • Author(s): Nobuo Niimura
  • Total Pages: 14
  • Publisher: InTech-Open Access Publisher
• [Book] Neutron Protein Crystallography. Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules (2011)
  • Author(s): Niimura, N., Podjarny, A
  • Total Pages: 233
  • Publisher: Oxford University Press