分子動力学／自由エネルギー計算によるＶ１ーＡＴＰａｓｅの機能発現機構の解明

• Project Area: Water plays a key role in ATP hydrolysis and ATP-driven functions of proteins
• Project/Area Number: 23118705
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 村田 武士 千葉大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (80415322)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2012: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2011: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: 分子モーター / 酵素反応 / V-ATPase / 計算機シミュレーション

Outline of Annual Research Achievements

本研究では得られたV1-ATPaseの結晶構造と機能を繋ぐ計算機シミュレーションを用いた解析や重要残基変異体の構造機能解析を行い、V1-ATPaseのATP加水分解による機能発現機構の解明を目的とする。当初研究計画に従って、下記の研究結果を得た。
分子動力学／自由エネルギー計算によるATP結合部位への基質結合親和性の算出---V1-ATPaseの３箇所のATP結合部位は、ヌクレオチドに対してそれぞれ違う親和性を持つことが実験的に示されているが、それぞれの結合親和性がどの箇所に対応するかは実証されていない。今年度は新たに得られた結晶構造のAMP-PNPを結合している２つのAサブユニット単体について、エネルギー計算によるATP結合部位への基質結合親和性を算出した。
分子動力学シミュレーションによる触媒サブユニットの揺らぎと水和の解析---前年度の短時間シミュレーションの結果を基に、V1-ATPaseの回転軸にトルクを掛けたTargeted MDを10 nS行った。合成方向と分解方向への回転に伴ったA3B3複合体の構造変化の違いについて調べた。
機能発現に重要な残基の変異酵素の作製と機能構造解析---上記の解析で得られた結果から予想されるヌクレオチド結合に重要と考えられる残基やDG複合体とA3B3複合体の接触面に位置し、回転反応に重要と考えられる残基に関して、部位特異的変異導入を行った。得られた変異V1-ATPaseを精製し、A3B3複合体とDG複合体の結合の親和性及びATPase活性への影響を調べた。これによりDG複合体の役割の一端を理解することができた。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Rotation mechanism of Enterococcus hirae V 1-ATPase based on asymmetric crystal structures (2013)
  • Author(s): Satoshi Arai, Shinya Saijo, Kano Suzuki, Kenji Mizutani, Yoshimi Kakinuma, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Noboru, Ohsawa, Takaho Terada, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, So Iwata, Ichiro Yamato and Takeshi Murata
  • Journal Title: Nature Volume: 493 Issue: 7434 Pages: 703-707
  • DOI: 10.1038/nature11778
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biochemical and biophysical properties of interactions between subunits of the peripheral stalk region of human V-ATPase (2013)
  • Author(s): Suhaila Rahman, Ichiro Yamato, Shinya Saijo, Kenji Mizutani, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Noboru Ohsawa, Takaho Terada, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, So Iwata and Takeshi Murata
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 8 Issue: 2 Pages: e55704-e55704
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0055704
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutagenesis of the residues forming an ion binding pocket of the NtpK subunit of Enterococcus hirae V-ATPase (2012)
  • Author(s): Miyuki Kawano-Kawada
  • Journal Title: J. Bacteriol. Volume: 194 Issue: 17 Pages: 4546-4549
  • DOI: 10.1128/jb.00714-12
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Calculating the Na+ translocating V-ATPase catalytic site affinity for substrate binding by homology modeled NtpA monomer using molecular dynamics/free energy calculation (2012)
  • Author(s): Zahed Muhammed
  • Journal Title: J.Mol.Graph.Model. Volume: (印刷中) Pages: 59-66
  • DOI: 10.1016/j.jmgm.2012.03.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the central axis DF complex of the prokaryotic V-ATPase (2011)
  • Author(s): Saijo, S.
  • Journal Title: Pioc Natl Acad Sci USA Volume: 108 Issue: 50 Pages: 19955-19960
  • DOI: 10.1073/pnas.1108810108
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Crystallization of membrane proteins using functional antibody fragments (2012)
  • Author(s): Takeshi Murata
  • Organizer: AsCA 12/CRYSTAL 28
  • Place of Presentation: オーストラリア（アデレード）
  • Invited
• [Presentation] V1-ATPaseのX線結晶構造解析 (2011)
  • Author(s): 村田武士
  • Organizer: 第37回生体エネルギー研究会
  • Place of Presentation: 京都産業大学(京都府)
  • Year and Date: 2011-12-22
• [Presentation] Enterococcus hirae由来V_1-ATPaseの結晶構造解析 (2011)
  • Author(s): 西條慎也
  • Organizer: 第84回生化学会
  • Place of Presentation: 京都国際会館(京都府)
  • Year and Date: 2011-09-22
• [Presentation] V1-ATPaseの結晶構造から見えてきた回転メカニズム (2011)
  • Author(s): 村田武士
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: 阪急エキスポパーク(大阪府)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-06-09
• [Book] 抗体を用いた膜タンパク質の結晶構造解析 (2012)
  • Author(s): 日野智也
  • Total Pages: 5
  • Publisher: NTS 新機能抗体開発ハンドブック
• [Remarks] 非対称な結晶構造から明らかになったV1-ATPaseの回転機構
  • URL: http://first.lifesciencedb.jp/archives/6593