アクチンフィラメントのB端方向への協同的構造変化とハイパーモバイル水の機能解明

• Project Area: Water plays a key role in ATP hydrolysis and ATP-driven functions of proteins
• Project/Area Number: 23118721
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 上田 太郎 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究部門付 (90356551)
• Project Period (FY): 2011 – 2012
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000); Fiscal Year 2012: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000); Fiscal Year 2011: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: アクチンフィラメント / ミオシン / 協同的構造変化 / 運動

Research Abstract

目的1(ミオシン結合により誘起されるアクチンフィラメントの一方向的な構造変化の検出):昨年度までに、アクチンとS1のキメラタンパク質とピレン標識した正常アクチンのブロック共重合体を作製し、ATPを添加したときのピレン蛍光強度の変化をモニターすることで、キメラタンパク質に起きた構造変化が、P端側に隣接するアクチンに伝播することを見出していた。しかし蛍光強度の変化幅が小さく、説得力に乏しいことが問題であった。変化幅が小さいのは、大量に混入するピレン標識アクチンのホモフィラメントの蛍光が大きいためだと考えられたので、今年度は、ピレン標識アクチンのホモフィラメントの分離除去を試みたが、おもわしい成果が得られなかった。そこで方針を大きく変更し、ミオシンの結合しやすさを指標にアクチンフィラメントの一方向的な構造変化を検出することとした。この場合は、電子顕微鏡または高速AFMによる検出となるので、ブロックコポリマーを精製する必要はない点が有利である。電子顕微鏡を用いた予備実験により、キメラタンパク質のホモポリマーブロックの両側に正常アクチンを重合させたブロックコポリマーがある程度生成され条件を確立した。
目的2(キメラタンパク質と正常アクチンが互いに共重合しにくい現象のメカニズム解明):昨年度までは、Alexa488とAlexa594という二つの蛍光色素で標識されたキメラタンパク質と正常アクチンの共重合を蛍光顕微鏡で観察し、二つの蛍光がフィラメント中で均一に混ざり合わないことから、キメラタンパク質内のアクチンは、正常アクチンとは異なる構造をとるのだろうと推測していた。しかし今年度の研究により、Alexa594にはタンパク質を凝集させる傾向があることが判明し、蛍光の不均一性はAlexa594の人工産物である可能性が排除できなくなった。今後は別の蛍光色素を用いて実験する必要がある。

Research Products

• [Journal Article] G146V mutation at the hinge region of actin reveals a myosin class-specific requirement of actin conformations for motility. (2012)
  • Author(s): Noguchi, T. Q. P., Komori, T., Umeki, N., Demizu, N., Ito, K., Iwane, A. H., Tokuraku, K., Yanagida, T., Uyeda, T. Q. P.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 279 Issue: 29 Pages: 24399-34345
  • DOI: 10.1074/jbc.m111.321752
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single restriction enzyme-assisted megaprimer polymerase chain reaction to fuse two DNA sequences on separate cloning vectors (2011)
  • Author(s): Umeki, N., Uyeda, T.Q.P.
  • Journal Title: Anal.Biochem. Volume: 414 Issue: 2 Pages: 309-311
  • DOI: 10.1016/j.ab.2011.03.023
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stretching actin filaments within cells enhances their affinity for the myosin II motor domain (2011)
  • Author(s): Uyeda, T.Q.P., Iwadate, Y., Umeki, N., Nagasaki, A., Yumura, S.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 6 Issue: 10 Pages: e26200-e26200
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0026200
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Cooperative conformational changes of actin filaments drive mutually exclusive cooperative binding of cofilin and HMM to the filaments. (2012)
  • Author(s): 梅木伸久、上田太郎
  • Organizer: 日本生物物理学会第50回年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)
  • Year and Date: 2012-09-23
• [Presentation] Structural polymorphism and functional differentiation of actin filaments. (2012)
  • Author(s): 上田太郎、梅木伸久、貴嶋紗久、西川雄亮、徳楽清孝、長崎晃、野口太郎
  • Organizer: 日本生物物理学会第50回年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)
  • Year and Date: 2012-09-23
• [Presentation] Analysis of cooperative interaction of Dictyostelium-derived cofilin and HMM to F-actin using fluorescence microscopy. (2012)
  • Author(s): 西川雄亮、佐藤あゆみ、上田太郎、徳楽清孝
  • Organizer: 日本生物物理学会第50回年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)
  • Year and Date: 2012-09-23
• [Presentation] ミオシン結合により誘起されるアクチンフィラメントの協同的構造変化-アクチンフィラメントの構造多型と機能分化- (2012)
  • Author(s): 上田太郎
  • Organizer: 公開シンポジウム「ゆらぎと水-生命のエネルギーと機能の分子機構を探る」
  • Place of Presentation: 大阪ガーデンパレス(大阪府)(招待講演)
  • Year and Date: 2012-09-15
• [Presentation] ミオシンHMMとコフィリンのアクチンフィラメントに対する協同的結合は相互排他的である (2011)
  • Author(s): 貴嶋紗久、梅木伸久、中嶋潤、野口太郎、徳楽清孝、上田太郎
  • Organizer: 第一回日本細胞性粘菌学会
  • Place of Presentation: 大阪大学(大阪府)
  • Year and Date: 2011-11-04
• [Presentation] Exelusive binding of myosin and cofilin to F-actin (2011)
  • Author(s): Kijima, S., Noguchi, T., Uyeda, T.Q.P., Tokuraku, K.
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 姫路工業大学(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-18
• [Presentation] Stretching actin filaments within cells enhances their affinity for the myosin II motordomain (2011)
  • Author(s): Uyeda, T.Q.P., Iwadate, Y., Umeki, N., Nagasaki, A., Yumura, S.
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 姫路工業大学(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] Unidirectional conformational changes of actin filaments : possible implications in force generation by myosin (2011)
  • Author(s): Kien, N.X., Katayama, E., Iwai, S., Suzuki, M., Uyeda, T.Q.P.
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 姫路工業大学(兵庫県)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] 優性阻害となるAsp11変異アクチンの解析 (2011)
  • Author(s): 中嶋潤、梅木伸久、野口太郎、徳楽清孝、長崎晃、上田太郎
  • Organizer: 2012年生体運動研究合同班会議
  • Place of Presentation: 筑波大学(茨城県)
  • Year and Date: 2011-01-07
• [Presentation] Acto-cofilin融合蛋白質によって誘導される、アクチンフィラメントの協同的構造変化 (2011)
  • Author(s): 梅木伸久、長崎晃、上田太郎
  • Organizer: 2012年生体運動研究合同班会議
  • Place of Presentation: 筑波大学(茨城県)
  • Year and Date: 2011-01-07
• [Presentation] ミオシンとコフィリンはF-アクチンに対して排他的に結合する (2011)
  • Author(s): 貴嶋紗久、梅木伸久、上田太郎、徳楽清孝、長崎晃、野口太郎
  • Organizer: 2012年生体運動研究合同班会議
  • Place of Presentation: 筑波大学(茨城県)
  • Year and Date: 2011-01-07
• [Presentation] アクチンの生化学的性質へのチロシン143変異の影響 (2011)
  • Author(s): 五味渕由貴、上田太郎、若林健之
  • Organizer: 2012年生体運動研究合同班会議
  • Place of Presentation: 筑波大学(茨城県)
  • Year and Date: 2011-01-07
• [Remarks]
  • URL: http://staff.aist.go.jp/t-uyeda/HP/Welcome.html