フラビン結合光センサードメインを鋳型とした酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発

• Project Area: Environmental sensing of plants: Signal perception, processing and cellular responses
• Project/Area Number: 23120513
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Nagoya Institute of Technology
• Principal Investigator: 岩田 達也 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (20569917)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2012: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2011: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
• Keywords: 蛍光タンパク質 / フラビン / LOVドメイン / 酸化還元反応 / 植物 / 可視化 / タンパク質 / 生物・生体工学 / バイオテクノロジー / 酸化還元状態

Outline of Annual Research Achievements

本研究において、シロイヌナズナフォトトロピンのLOV2ドメイン（Q376-Q500）のC426A変異体（LOV(C/A)と表記）を用いて、LOV(C/A)を発現させた大腸菌体を用いた蛍光タンパク質のスクリーニング法を確立した。蛍光分光光度計の励起光照射によりLOV(C/A)の蛍光強度が減少する（LOVに結合したFMNが細胞内の還元雰囲気下でセミキノン形が生成する）ことから、LOV(C/A)より光還元速度が速く、定常状態でより低い蛍光強度を示すランダム変異体Mut12を選別した。また、同じ条件でiLOVを発現させた大腸菌では蛍光強度の減少はわずかであった。
これらの大腸菌をPBSバッファに懸濁して24時間放置したとき、定常状態での蛍光強度が放置前のものより高くなった。このことは栄養飢餓ストレスを与えたことにより細胞内部がより酸化的になったのではないかと考え、細胞内NADH／NAD+の量を調べたところ、その比は減少していた。また、定常状態の蛍光強度とNADH／NAD+比には相関が見られ、NADH／NAD+比が高いと蛍光強度が小さくなることがわかった。Mut12（やLOV(C/A)）は細胞内の酸化還元環境に応答して蛍光強度を変化させていることが強く示唆される結果となった。
［今後の展望］
この蛍光タンパク質の実用化に向けて、LOV(C/A)とMut12、iLOVの精製タンパク質を用いて、光照射後の蛍光強度と酸化還元電位の相関を調べているところである。また、異なる酸化還元中点電位をもつ一連の変異体のスクリーニングも進めている。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] "Detection of distinct α-helical rearrangements of CPD photolyase upon substrate binding by FTIR spectroscopy" (2013)
  • Author(s): I M. M. Wijaya, Y. Zhang, T. Iwata, J. Yamamoto, K. Hitomi, S. Iwai, E. D. Getzoff and H. Kandori
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 52 Issue: 6 Pages: 1019-1027
  • DOI: 10.1021/bi3016179
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] "The influence of halide binding on the hydrogen bonding network in the active site of Salinibacter sensory rhodopsin I" (2012)
  • Author(s): L. Reissig, T. Iwata, T. Kikukawa, M. Demura, N. Kamo, H. Kandori and Y. Sudo
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 51 Issue: 44 Pages: 8802-8813
  • DOI: 10.1021/bi3009592
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] "FTIR study of the photoactivation process of Xenopus (6-4) photolyase" (2012)
  • Author(s): D. Yamada, Y. Zhang, T. Iwata, K. Hitomi, E. D. Getzoff and H. Kandori
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 51 Issue: 29 Pages: 5774-5783
  • DOI: 10.1021/bi300530x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Light-induced structural changes of the LOV2 domains in various phototropins revealed by FTIR spectroscopy (2011)
  • Author(s): Iwata, T., Tokutomi, S., Kandori, H.
  • Journal Title: BIOPHYSICS Volume: 7 Issue: 0 Pages: 89-98
  • DOI: 10.2142/biophysics.7.89
  • NAID: 130001253118
  • ISSN: 1349-2942
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Substrate Assignment of the (6-4) Photolyase Reaction by FTIR Spectroscopy (2011)
  • Author(s): Y.Zhang, J.Yamamoto, D.Yamada, T.Iwata, K.Hitomi, T.Todo, E.D.Getzoff, S.Iwai, H.Kandori
  • Journal Title: J.Phys.Chem.Lett. Volume: 183 Issue: 21 Pages: 2774-2777
  • DOI: 10.1021/jz201250b
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Strong donation of the hydrogen bond of tyrosine during photoactivation of the BLUF domain (2011)
  • Author(s): T.Iwata, A.Watanabe, M.Iseki, M.Watanabe, H.Kandori
  • Journal Title: J.Phys.Chem.Lett. Volume: 2 Issue: 9 Pages: 1015-1019
  • DOI: 10.1021/jz2003974
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] FTIR study of light-dependent activation and DNA repair processes of (6-4) photolyase (2011)
  • Author(s): Zhang Y, et al
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 50 Issue: 18 Pages: 3591-3598
  • DOI: 10.1021/bi1019397
  • Peer Reviewed
• [Presentation] フラビンタンパク質とは?-その歴史から新規機能性タンパク質の開発まで (2013)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 日本植物生理学会シンポジウム「フラビン酵素の植物生理学」
  • Place of Presentation: 岡山大学
  • Year and Date: 2013-03-21
  • Invited
• [Presentation] フラビン結合光センサードメインを鋳型とした酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発 (2013)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 新学術領域研究「植物の環境感覚：刺激受容から細胞応答まで」 2012年度第2回班会議
  • Place of Presentation: キャンパスプラザ京都
  • Year and Date: 2013-03-08
• [Presentation] Protein bound water molecules of channelrhodopsin (2013)
  • Author(s): ○S. Ito, H. Kato, T. Iwata, O. Nureki and H. Kandori
  • Organizer: Nagoya Symposium - Frontiers in Structural Physiology
  • Place of Presentation: Nagoya University
  • Year and Date: 2013-01-22
• [Presentation] タンパク質の赤外分光計測で何がわかるか？ (2013)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 神戸大学先端融合科学シンポジウム「タンパク質の低振動ダイナミクス：水和と熱活性」
  • Place of Presentation: 神戸大学
  • Invited
• [Presentation] CPD- and (6-4) Photolyase's Distinct α-helices Rearrangement upon DNA Binding by FTIR Spectroscopy (2013)
  • Author(s): ○I M. M. Wijaya、張宇、岩田達也、山元淳平、人見研一、岩井成憲、E. D. Getzoff、神取秀樹
  • Organizer: 日本生物物理学会中部支部講演会
  • Place of Presentation: 名古屋大学
• [Presentation] LOVドメインを鋳型とした酸化還元感受性タンパク質の開発 (2012)
  • Author(s): ○小野友紀子、岩田達也、神取秀樹
  • Organizer: 第43回中部化学関係学協会支部連合秋季大会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学
  • Year and Date: 2012-11-10
• [Presentation] Enzyme and DNA Substrate Assignment of E. coli CPD Photolyase by FTIR Spectroscopy (2012)
  • Author(s): ○I M. M. Wijaya、張宇、岩田達也、山元淳平、人見研一、岩井成憲、E. D. Getzoff、神取秀樹
  • Organizer: 第43回中部化学関係学協会支部連合秋季大会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学
  • Year and Date: 2012-11-10
• [Presentation] (6-4)光回復酵素の低温におけるDNA修復中間体の測定 (2012)
  • Author(s): ○山田大智、岩田達也、神取秀樹
  • Organizer: 第43回中部化学関係学協会支部連合秋季大会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学
  • Year and Date: 2012-11-10
• [Presentation] BLUF domainにおける活性中心の水素結合環境変化 (2012)
  • Author(s): ○伊藤奨太、岩田達也、神取秀樹
  • Organizer: 第43回中部化学関係学協会支部連合秋季大会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学
  • Year and Date: 2012-11-10
• [Presentation] 細胞内酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発 (2012)
  • Author(s): ○岩田達也、小野友紀子、神取秀樹
  • Organizer: 新学術領域研究「植物の環境感覚：刺激受容から細胞応答まで」第3回若手の会
  • Place of Presentation: 浜名湖カリアック
  • Year and Date: 2012-10-15
• [Presentation] チャネルロドプシンの内部結合水の赤外分光解析 (2012)
  • Author(s): ○伊藤奨太、加藤英明、岩田達也、濡木 理、神取秀樹
  • Organizer: 第4回光操作研究会
  • Place of Presentation: 岡崎コンファレンスセンター
  • Year and Date: 2012-09-27
• [Presentation] Structural changes of hydrogen-bonding environment upon the photoreaction of the BLUF domains (2012)
  • Author(s): ○T. Iwata, S. Ito, M. Iseki, M. Watanabe and H. Kandori
  • Organizer: The 50th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Nagoya University
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] Repair of damaged DNA by the anion radical form of (6-4) photolyase (2012)
  • Author(s): ○D. Yamada, Y. Zhang, T. Iwata, J. Yamamoto, K. Hitomi, S. Iwai, T. Todo, E. D. Getzoff and H. Kandori
  • Organizer: The 50th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Nagoya University
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] Construction of LOV-based redox-sensitive fluorescent proteins (2012)
  • Author(s): ○Y. Ono, T. Iwata and H. Kandori
  • Organizer: The 50th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Nagoya University
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] FTIR study of Aureochrome that possesses LOV domain at the C-terminus (2012)
  • Author(s): ○S. Ito, Y. Zhang, T. Iwata, O. Hisatomi, F. Takahashi, H. Kataoka and H. Kandori
  • Organizer: The 50th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Nagoya University
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] BLUFドメインの光活性化に伴う水素結合構造の赤外分光解析 (2012)
  • Author(s): 岩田達也、伊藤奨太、伊関峰生、渡辺正勝、○神取秀樹
  • Organizer: 第6回分子科学討論会
  • Place of Presentation: 東京大学
  • Year and Date: 2012-09-18
• [Presentation] アニオンラジカル型FADを安定にもつ(6-4)光回復酵素変異体によるDNA修復 (2012)
  • Author(s): ○山田大智、岩田達也、神取秀樹
  • Organizer: 第52回生物物理若手の会夏の学校
  • Place of Presentation: 支笏湖ユースホステル
  • Year and Date: 2012-08-31
• [Presentation] BLUFドメインの光活性化に伴う水素結合構造の赤外分光解析 (2012)
  • Author(s): ○伊藤奨太、岩田達也、神取秀樹
  • Organizer: 第52回生物物理若手の会夏の学校
  • Place of Presentation: 支笏湖ユースホステル
  • Year and Date: 2012-08-31
• [Presentation] FTIR study of the photoactivation process of Xenopus (6-4) photolyase (2012)
  • Author(s): ○D. Yamada, Y. Zhang, T. Iwata, K. Hitomi, E. D. Getzoff and H. Kandori
  • Organizer: The 244th American Chemical Society (ACS) National Meeting "Photochemistry in Biology"
  • Place of Presentation: Philadelphia, USA
  • Year and Date: 2012-08-19
• [Presentation] BLUF ドメインの光誘起反応における水素結合環境変化 (2012)
  • Author(s): ○岩田達也、伊藤奨太、伊関峰生、渡辺正勝、神取秀樹
  • Organizer: 第17回日本光生物学協会年会
  • Place of Presentation: 大阪大学
  • Year and Date: 2012-08-17
• [Presentation] LOVドメインを鋳型とした酸化還元感受性タンパク質の開発 (2012)
  • Author(s): ○小野友紀子、岩田達也、神取秀樹
  • Organizer: 新学術領域研究「高次π空間」第8回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 加賀 ホテル アローレ
  • Year and Date: 2012-07-19
• [Presentation] フラビン結合光センサードメインを鋳型とした酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発 (2012)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 新学術領域研究「植物の環境感覚：刺激受容から細胞応答まで」2012年度第1回班会議
  • Place of Presentation: 岩手大学
  • Year and Date: 2012-06-15
• [Presentation] BLUF ドメインの光誘起反応における水素結合環境変化 (2012)
  • Author(s): ○伊藤奨太、岩田達也、伊関峰生、渡辺正勝、神取秀樹
  • Organizer: 第39回生体分子科学討論会
  • Place of Presentation: 東北大学
  • Year and Date: 2012-06-08
• [Presentation] アニオンラジカル型による(6-4)光回復酵素のDNA修復 (2012)
  • Author(s): 山田大智、岩田達也、神取秀樹
  • Organizer: 2011年度生物物理学会中部支部講演会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2012-03-19
• [Presentation] フラビン結合光センサードメインを鋳型とした酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発 (2012)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 新学術領域研究「植物の環境感覚:刺激受容から細胞応答まで」2011年度第2回班会議
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2012-02-19
• [Presentation] Hydrogen-bonding structures of the tyrosine and glutamine residues in the BLUF domain (2012)
  • Author(s): T.Iwata, S.Ito, M.Iseki, M.Watanabe, H.Kandori
  • Organizer: Gordon Research Conference "Photosensory Receptors & Signal Transduction"
  • Place of Presentation: Galveston, USA
  • Year and Date: 2012-01-24
• [Presentation] BLUF ドメインにおける活性中心の水素結合変化 (2012)
  • Author(s): ○伊藤奨太、岩田達也、伊関峰生、渡辺正勝、神取秀樹
  • Organizer: 分子科学シンポジウム「生体分子と水素結合」
  • Place of Presentation: 早稲田大学
• [Presentation] フラビンを発色団とする光センサータンパク質 (2011)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 生物物理化学研究会シンポジウム「光といのち」
  • Place of Presentation: 名古屋(招待講演)
  • Year and Date: 2011-12-25
• [Presentation] DNA光回復酵素の活性化と修復 (2011)
  • Author(s): 山田大智、張宇、岩田達也、山元淳平、人見研一、岩井成憲、藤堂剛、E.D.Getzoff、神取秀樹
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2011-12-21
• [Presentation] FTIRを用いた(6-4)光回復酵素の活性化過程における分光解析 (2011)
  • Author(s): 山田大智、張宇、岩田達也、人見研一、藤堂剛、E.D.Getzoff、神取秀樹
  • Organizer: 第17回錯体化学若手の会中部・東海地区勉強会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2011-11-12
• [Presentation] FTIR study of light-dependent activation and DNA repair processes of (6-4) photolyase (2011)
  • Author(s): Y.Zhang, J.Yamamoto, D.Yamada, T.Iwata, K.Hitomi, S.Iwai, T.Todo, E.D.Getzoff, H.Kandori
  • Organizer: 17th International Biophysics Congress and 12th National Biophysics Congress
  • Place of Presentation: Beijing, China
  • Year and Date: 2011-10-31
• [Presentation] BLUFドメインの光反応におけるチロシンとグルタミン残基の構造 (2011)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 新学術領域研究「植物の環境感覚:刺激受容から細胞応答まで」第2回若手の会
  • Place of Presentation: 滋賀
  • Year and Date: 2011-10-26
• [Presentation] 新規蛍光タンパク質の開発-細胞内酸化還元状態の可視化- (2011)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 名工大・名市大合同テクノフェア2011
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2011-10-20
• [Presentation] Spectroscopic study of the photoactivation process of Xenopus (6-4) photolyase (2011)
  • Author(s): D.Yamada, Y.Zhang, T.Iwata, K.Hitomi, T.Todo, E.D.Getzoff, H.Kandori
  • Organizer: International Workshop on "Spectroscopy on Photoinduced Functions of Electrons and Spins in Biology and Material Science
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 2011-10-13
• [Presentation] ^<15>Nラベルした(6-4)光産物修復の赤外分光観測 (2011)
  • Author(s): 張宇、山田大智、岩田達也、山元淳平、人見研一、岩井成憲、藤堂剛、E.D.Getzoff、神取秀樹
  • Organizer: 第5回分子科学討論会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2011-09-20
• [Presentation] Hydrogen-bonding structures of glutamine and tyrosine residues during the photoreaction of the BLUF domains (2011)
  • Author(s): T.Iwata, M.Iseki, M.Watanabe, H.Kandori
  • Organizer: The 49th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Himeji, Japan
  • Year and Date: 2011-09-18
• [Presentation] FTIR study of light-dependent activation and DNA repair processes of E.coli CPD photolyase (2011)
  • Author(s): I M.M.Wijaya, Y.Zhang, T.Iwata, J.Yamamoto, S.Iwai, H.Kandori
  • Organizer: The 49th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Himeji, Japan
  • Year and Date: 2011-09-18
• [Presentation] Spectroscopic study of light-dependent activation and DNA repair processes of Xenopus (6-4) photolyase (2011)
  • Author(s): D.Yamada, Y.Zhang, T.Iwata, J.Yamamoto, K.Hitomi, S.Iwai, T.Todo, E.D.Getzoff, H.Kandori
  • Organizer: The 49th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Himeji, Japan
  • Year and Date: 2011-09-18
• [Presentation] Functional conversion of green-proteorhodopsin by site-directed mutagenesis (2011)
  • Author(s): R.Abe-Yoshizumi, K.Inoue, T.Iwata, H.Kandori
  • Organizer: The 49th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • Place of Presentation: Himeji, Japan
  • Year and Date: 2011-09-18
• [Presentation] アフリカツメガエルの(6-4)光回復酵素における活性化過程の分光解析 (2011)
  • Author(s): 山田大智、張宇、岩田達也、人見研一、藤堂剛、E.D.Getzoff、神取秀樹
  • Organizer: 第51回生物物理若手の会夏の学校
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2011-08-25
• [Presentation] Structure of tyrosine residue in the unphotolyzed and intermediate states of the BLUF domains (2011)
  • Author(s): T.Iwata, A.Watanabe, M.Iseki, M.Watanabe, H.Kandori
  • Organizer: 5th Asia and Oceania Conference for Photobiology
  • Place of Presentation: Nara, Japan
  • Year and Date: 2011-07-31
• [Presentation] Spectroscopic study of the photoactivation process of Xenopus (6-4) photolyase (2011)
  • Author(s): D.Yamada, Y.Zhang, T.Iwata, K.Hitomi, T.Todo, E.D.Getzoff, H.Kandori
  • Organizer: 5th Asia and Oceania Conference for Photobiology
  • Place of Presentation: Nara, Japan
  • Year and Date: 2011-07-31
• [Presentation] フラビン結合光センサードメインを鋳型とした酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発 (2011)
  • Author(s): 岩田達也
  • Organizer: 新学術領域研究「植物の環境感覚:刺激受容から細胞応答まで」2011年度第1回班会議
  • Place of Presentation: 岡崎
  • Year and Date: 2011-06-27
• [Presentation] (6-4)光回復酵素における活性化過程の分光解析 (2011)
  • Author(s): 山田大智、張宇、岩田達也、人見研一、藤堂剛、E.D.Getzoff、神取秀樹
  • Organizer: 第38回生体分子科学討論会
  • Place of Presentation: 筑波
  • Year and Date: 2011-06-24
• [Presentation] Light-induced activation processes of the cryptochrome/photolyase family detected by FTIR spectroscopy (2011)
  • Author(s): T.Iwata
  • Organizer: BIT Life Sciences' 2nd Symposium on Enzymes & Biocatalysis-2011
  • Place of Presentation: Dalian, China(招待講演)
  • Year and Date: 2011-04-27
• [Remarks] 神取研究室ホームページ
  • URL: http://www.ach.nitech.ac.jp/~physchem/kandori/index_j.html