ヒト毛髪内亜鉛・カルシウム恒常性維持のための分子構造変換機構の解明

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121504
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 海野 昌喜 茨城大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (10359549)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2012: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2011: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
• Keywords: 毛髪 / 恒常性維持 / 構造変換 / 毛髪キューティクル / S100A3 / PAD3 / 結晶 / 構造 / 複合体 / 特異的基質認 / シトルリン化

Outline of Annual Research Achievements

昆虫細胞培養により得られたS100A3の構造は、分子内に二つのジスルフィド結合を有していた（SS1とSS2と呼ぶ）。SS1とSS2の生理的意義を解明するため、それらをそれぞれ削った（対象のCysをAlaに変異した）変異体のカルシウム結合能とPAD3との反応性を調べたところ、SS1を欠失した変異体では、カルシウム結合能が下がり、PAD3によるシトルリン化を受けにくくなった。一方、SS2を欠失した変異体では、カルシウム結合能もシトルリン化され安さも上昇した。このように、S100A3内の二つのジスルフィド結合が、カルシウム恒常性維持を相補的に制御していることを見出した。また、SS1に関しては、カルシウム結合に有利な構造を形成するため、必要な形で必要な場所にあることも明らかになった。さらに、高分解能の構造では、N末端のアセチル化も原子レベル構造で確認でき、大腸菌発現では成されないこれらの翻訳後修飾が、S100A3の機能にとって重要であることも明らかになった。
PAD3のアイソザイムであるPAD1やPAD2による基質認識の違いを明らかにするため、まず、PAD3の大量発現・精製・結晶化を行った。PAD3の結晶は、少なくとも3つの全く異なった結晶化条件で得られたが、得られた結晶は、いずれも同じ結晶系であった。空間群R3, a = b = 114.97 Aring;, c = 332.49 Aring;で、非対称単位に二分子（二量体で働くので、一つの生物学的単位）が含まれていた。現在までに最高2.95Aring;分解能の回折データを得て、この分解能で構造も決定した。結晶の対称性が高いので、回折データのredundancyを容易に稼げるうえ、非結晶学的平均化法で、電子密度図は分解能の割に明瞭なものが得られた。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Human S100A3 tetramerization propagates Ca(2+)/Zn(2+) binding states (2013)
  • Author(s): Kizawa, K., Jinbo, Y., Inoue, T., Takahara, H., Unno, M., Heizmann, C. W., Izumi, Y.
  • Journal Title: Biochim. Biopys. Acta Volume: 1833 Issue: 7 Pages: 1712-1719
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2012.07.009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of human peptidylarginine deiminase type III. (2012)
  • Author(s): Unno, M.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. Volume: 68 Issue: 6 Pages: 668-670
  • DOI: 10.1107/s1744309112015333
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] S100 and S100 fused-type protein families in epidermal maturation with special focus on S100A3 in mammalian hair cuticles (2011)
  • Author(s): Kizawa, K., et al.
  • Journal Title: Biochimie Volume: 93 Issue: 12 Pages: 2038-2047
  • DOI: 10.1016/j.biochi.2011.05.028
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Binding and selectivity of the marine toxins neodysiherbaine A, and its synthetic analogues, to GluK1 and GIuK2 kainate receptors (2011)
  • Author(s): M.Unno, M.Shinohara, K.Takayama, H.Tanaka, K.Teruya, K.Doh-ura, R.Sakai, M.Sasaki, M.Ikeda-Saito
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology Volume: 413 Issue: 3 Pages: 667-683
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2011.08.043
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Refined Crystal Structures of Human Ca^<2+>/Zn^<2+>-Binding S100 A3 Protein Characterized by Two Disulfide Bridges (2011)
  • Author(s): Unno, M., et al.
  • Journal Title: J.Mol.Biol. Volume: 408 Issue: 3 Pages: 477-490
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2011.02.055
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] X-ray Crystallography of A Metalloprotein: A Reaction Intermediate of Heme Oxygenase (2011)
  • Author(s): 海野昌喜, 他
  • Journal Title: Nihon Kessho Gakkaishi Volume: 53 Issue: 3 Pages: 213-218
  • DOI: 10.5940/jcrsj.53.213
  • NAID: 10029371570
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヒト毛髪内脱イミノ化酵素PAD3のD350A変異体の精製と結晶化 (2012)
  • Author(s): 秋元恵
  • Organizer: 平成24年日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2012-10-25
• [Presentation] Human S100A3 tetramerization propagates Ca2+/Zn2+ binding states (2012)
  • Author(s): Kizawa, K.
  • Organizer: 12th meeting of the European Calcium Society
  • Place of Presentation: Toulouse, France
  • Year and Date: 2012-09-09
• [Presentation] Two intramolecular disulfide bridges in S100A3 affect on the Ca2+-binding property (2012)
  • Author(s): Unno, M.
  • Organizer: 12th meeting of the European Calcium Society
  • Place of Presentation: Toulouse, France
  • Year and Date: 2012-09-09
• [Presentation] 毛髪内Zn2+/Ca2+恒常性維持のためのS100A3, PAD3蛋白質の構造変換 (2012)
  • Author(s): 海野昌喜
  • Organizer: 第39回生体分子科学討論会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2012-06-08
• [Presentation] 構造生物学的手法で明らかにした毛髪キューティクルS100A3蛋白質の分子内ジスルフィド結合の重要性 (2011)
  • Author(s): 海野昌喜, 他
  • Organizer: 日本化学会関東支部茨城地区研究交流会
  • Place of Presentation: 東海村
  • Year and Date: 2011-11-04
• [Presentation] 構造生物学的手法で明らかにした毛髪キューティクルS100A3蛋白質の分子内ジスルフィド結合の重要性 (2011)
  • Author(s): 海野昌喜, 他
  • Organizer: 第84会日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2011-09-24
• [Presentation] Two Disulfide Bridges in S100A3 Crucial for the Natural Substrate Recognition by PAD3 (2011)
  • Author(s): Hidenari Takahara, et al
  • Organizer: 41st Annual Meeting of the European Society for Dermatological Research
  • Place of Presentation: Barcelona, Spain
  • Year and Date: 2011-09-07
• [Book] Calcium-Binding Proteins and RAGE (Methods in Molecular Biology) (2012)
  • Author(s): Kizawa, K.
  • Total Pages: 338
  • Publisher: Springer
• [Remarks] 茨城大学フロンティア応用原子科学研究センター 海野研究室
  • URL: http://www.fas.ibaraki.ac.jp/?page_id=827
• [Remarks]
  • URL: http://www.fas.ibaraki.ac.jp/?page_id=827