毒素タンパク質のシグナル伝達活性化メカニズムの構造的基盤

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121515
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto Institute of Technology
• Principal Investigator: 北所 健悟 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 准教授 (60283587)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2012: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2011: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: シグナル伝達 / 感染症 / パスツレラ毒素 / X線構造解析 / 分子認識 / 結晶化 / GTPase

Outline of Annual Research Achievements

PMT活性発現領域(C-PMT)とGαi2ペプチド複合体の結晶化および立体構造の解析
C-PMT変異体並びにGi2αサブユニット(Gαi2)については大腸菌での大量発現系を用いて、アフィニティクロマトで精製することができた。既に結晶構造を決定した変異体（3種類；C1159S, C1165S, C1159SC1165Sダブルミュータント）を用いて、この標的分子のGαi2の認識部分の（20 アミノ酸；IFRMVDVGGQRSERRKWIH並びにその類縁ペプチド）との複合体結晶を数種類作成し、SPring-8において回折データ測定を行った。種々の結晶化スクリーニングの結果、Native 結晶とは結晶化条件や形状並びに空間群など結晶系の異なる数種類の共結晶を得ることができた。構造解析の結果、Gタンパク質の脱アミド化修飾を受けるGln残基のN末端側に存在する2つのGly残基、1つのVal残基がPMTの活性中心付近のクレフト内で相互作用することで、結合に関与していることが明らかになった。
C-PMTとヘテロ三量体GTP結合タンパク質Gαi2の複合体の結晶化
C-PMT並びにGαi2については大腸菌での大量発現系を用いて、アフィニティクロマトで精製した。C-PMT とGαi2との複合体結晶を、数種類の異なる沈殿剤の条件下で作成した。不活型のC-PMT(C1165S並びにC1159SC1165Sダブルミュータント) とGαi2との複合体結晶のスクリーニングについて結晶化を行った。予備的な結晶化条件から、濃縮方法を検討し、C-PMTとGタンパク質複合体の結晶化を行ったところ、リン酸共存下で複合体状態での結晶を確認することに成功した。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Visualization of mitochondria in living cells with a genetically encoded yellow fluorescent protein originating from a yellow-emitting luminous bacterium. (2013)
  • Author(s): Karatani H, (他8 名、8 番目)
  • Journal Title: Photochem Photobiol Sci. Volume: Epub ahead of print Issue: 5 Pages: 944-956
  • DOI: 10.1039/c3pp25360k
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of cutinase Est119 from Thermobifida alba AHK119 that can degrade modified polyethylene terephthalate at 1.7A resolution. (2012)
  • Author(s): Kitadokoro K, (他 6 名、1 番目)
  • Journal Title: Polym.Degrad.Stab., Volume: 97 Issue: 5 Pages: 771-775
  • DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2012.02.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal Structure of Clostridiumperfringensenterotoxin displays features of β-pore-forming toxins (2011)
  • Author(s): Kitadokoro, K., Nishimura, K., Kamitani, S., Fukui-Miyazaki, A., Toshima, H., Abe, H., Kamata, Y., Sugita-Konishi, Y., Yamamoto, S., Karatani, H., and Horiguchi, Y
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 286 Issue: 22 Pages: 19549-19555
  • DOI: 10.1074/jbc.m111.228478
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary crystallographic studies on the HA3 subcomponent of type B botulinumneurotoxin complex (2011)
  • Author(s): Nishimura K, Kitadokoro K, Takegahara Y, Sugawara Y, Matsumura T, Karatani H, Fujinaga Y
  • Journal Title: ActaCryst.F Volume: 67 Issue: 10 Pages: 1244-1246
  • DOI: 10.1107/s1744309111027412
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A histone-like protein of mycobacteria possesses ferritin superfamily protein-like activity and protects against DNA damage by Fenton reaction (2011)
  • Author(s): Takatsuka M, Osada-Oka M, Satoh EF, Kitadokoro K, Nishiuchi Y, Niki M, et al
  • Journal Title: PLoS One Volume: 6 Issue: 6 Pages: e20985-e20985
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0020985
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Enzymatic actions of Pasteurella multocida toxin detected by monoclonal antibody recognizing the deamidated alpha subunit of the heterotrimeric GTPase Gq (2011)
  • Author(s): Kamitani, S., Ao, S., Toshima, H., Tachibana, T., Hashimoto, M., Kitadokoro, K., Fukui-Miyazaki, A., Abe, H., and Horiguchi, Y.
  • Journal Title: FEBS J Volume: 278 Issue: 15 Pages: 2702-2712
  • DOI: 10.1111/j.1742-4658.2011.08197.x
  • Peer Reviewed
• [Presentation] B型ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンのX線結晶構造解析 (2012)
  • Author(s): 阿松翔, 菅原庸, 松村拓大, 柄谷肇, 藤永由佳子, 北所健悟
  • Organizer: 第59回 毒素シンポジウム
  • Place of Presentation: 北海道・帯広・とかちプラザ
  • Year and Date: 2012-08-30
• [Presentation] B型ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンのX線結晶構造解析 (2012)
  • Author(s): 阿松翔, 菅原庸, 松村拓大, 柄谷肇, 藤永由佳子, 北所健悟
  • Organizer: 日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場
  • Year and Date: 2012-06-20
• [Presentation] ウェルシュ菌の産生する食中毒病原因子CPEの構造および機能解析 (2011)
  • Author(s): 西村昂亮・神谷重樹・福井理・戸嶋ひろ野・安倍裕順・鎌田洋一・小西良子・山本茂貴・柄谷肇・堀口安彦・北所健悟
  • Organizer: 日本結晶学会総会・平成23年度年会および総会
  • Place of Presentation: 北海道大学
  • Year and Date: 2011-11-24