バクテリアべん毛フック完成シグナリング複合体の機能構造解析

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121516
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 南野 徹 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20402993)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2012: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2011: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
• Keywords: 蛋白質 / 細菌 / 電子顕微鏡 / 分子モーター / 生物物理

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、X線結晶構造解析法および極低温電子顕微鏡による画像解析法と、遺伝学的機能解析法とを上手く組み合わせることで、サルモネラ菌べん毛フック完成シグナリング複合体形成とそれに伴う蛋白質輸送装置の輸送スイッチの分子機構を原子レベルで解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。
1.　FliJの分子表面に露出している、非常に高く保存された領域がFlhAとの相互作用に直接関わっていることが明らかとなった。
2.　FlhAのC末細胞質領域(FlhAc)のD1およびD2ドメインの境界面に保存されている疎水性の窪みに存在するPhe-459をアラニンに置換すると、べん毛繊維形成に関わる蛋白質の輸送量は著しく低下したが、フック形成に関わる蛋白質の輸送量は低下しなかった。さらに、F459A変異により、繊維形成に関わる蛋白質に特異的な分子シャペロンに対する結合親和性が低下したことが判明した。このことから、FlhAcは輸送スイッチとして働くことが示唆された。
3.　FlgNのSe-Met誘導体結晶や通常の浸漬法による重原子同型置換体結晶を作製したが、位相決定できなかった。そこで、Cysを導入したFlgN変異体を6種類作成し、そのうちいくつかのものから水銀置換体結晶を得ることができた。FlhAc(F459A)のnative結晶を得ることができた。
4.　極低温電子線トモグラフィー法により野生株およびfliH-fliIバイパス変異株の輸送装置の構造解析を進めた。トモグラム数が十分得られなかったために分解能は極めて低かったが、FliI ATPaseであると考えられる電子密度を同定することができた。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Interaction between FliJ and FlhA, components of the bacterial flagellar type III export apparatus. (2013)
  • Author(s): Ibuki, T., et al
  • Journal Title: J. Bacteriol. Volume: 195 Issue: 3 Pages: 466-473
  • DOI: 10.1128/jb.01711-12
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Isolation of Salmonella mutants resistant to the inhibitory effect of salicylidene acylhydrazides on flagella-mediated motility. (2013)
  • Author(s): Martinez-Argudo, I., et al
  • Journal Title: PLoS One Volume: 8 Issue: 1 Pages: e52179-e52179
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0052179
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction of the extreme N-terminal region of FliH with FlhA is. required for efficient bacterial flagellar protein export. (2012)
  • Author(s): Hara, N., et al
  • Journal Title: J. Bacteriol. Volume: 194 Issue: 19 Pages: 5353-5360
  • DOI: 10.1128/jb.01028-12
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of EscP(Orf16) in Injectisome Biogenesis and Regulation of Type III Protein Secretion in Enteropathogenic Escherichia coli. (2012)
  • Author(s): Monjaras F. J., et al
  • Journal Title: J. Bacteriol. Volume: 194 Issue: 22 Pages: 6029-6045
  • DOI: 10.1128/jb.01215-12
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the FliH-FliI complex responsible for bacterial flagellar type III protein export. (2012)
  • Author(s): Uchida, Y., et al
  • Journal Title: Acta Cryst. Volume: F68 Issue: 11 Pages: 1311-1314
  • DOI: 10.1107/s1744309112030801
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction between FliI ATPase and a flagellar chaperone FliT during bacterial flagellar protein export. (2012)
  • Author(s): Minamino, T., et al
  • Journal Title: Molecular Microbiology Volume: 83 Issue: 1 Pages: 168-178
  • DOI: 10.1111/j.1365-2958.2011.07924.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction of a flagellar chaperone FlgN with FlhA is required for efficient export of its cognate substrates. (2012)
  • Author(s): Minamino, T., et al
  • Journal Title: Mol. Microbiol. Volume: 83 Issue: 4 Pages: 775-788
  • DOI: 10.1111/j.1365-2958.2011.07964.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An energy transduction mechanism used in bacterial flagellar type III protein export (2011)
  • Author(s): Minamino, T., et al
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 2 Issue: 1 Pages: 475-475
  • DOI: 10.1038/ncomms1488
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 輸送シヤペロンFliTの構造とべん毛形成制御の分子機構 (2011)
  • Author(s): 今田勝巳, et al.
  • Journal Title: 日本結晶学会誌 Volume: 53 Pages: 396-401
  • Peer Reviewed
• [Presentation] べん毛特異的分子シャペロンと輸送ゲート構成蛋白質FlhAとの相互作用 (2013)
  • Author(s): 南野徹
  • Organizer: 第86回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 幕張メッセ（千葉県）
  • Year and Date: 2013-03-18
  • Invited
• [Presentation] バクテリアべん毛輸送ゲート構成蛋白質 FliP の機能構造解析 (2013)
  • Author(s): 福村拓真
  • Organizer: 2012年度べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: よろこびの宿 しん喜（群馬県）
  • Year and Date: 2013-03-03
• [Presentation] べん毛III型輸送装置構成タンパク質FliPのプリペラズム領域の結晶化と機能解析 (2012)
  • Author(s): 福村拓真
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第38回討論会
  • Place of Presentation: 岡山大学（岡山県）
  • Year and Date: 2012-12-22
• [Presentation] べん毛III型輸送装置蛋白質FlhAの細胞質領域の構造変化 (2012)
  • Author(s): 小川雄也
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第38回討論会
  • Place of Presentation: 岡山大学（岡山県）
  • Year and Date: 2012-12-22
• [Presentation] べん毛III型輸送装置蛋白質FlhAの細胞質フラグメントの構造とドメインの動き (2012)
  • Author(s): 小川雄也
  • Organizer: 第85回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡県）
  • Year and Date: 2012-12-14
• [Presentation] 細菌べん毛特異的シャペロンFliT のC 末αヘリックの役割 (2012)
  • Author(s): 南野徹
  • Organizer: 第50回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学（愛知県）
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] べん毛輸送装置近傍の局所pH に対するFliI ATPase の効果 (2012)
  • Author(s): 森本雄祐
  • Organizer: 第50回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学（愛知県）
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] べん毛輸送装置構成タンパク質FliP ペリプラズム領域の構造機能解析 (2012)
  • Author(s): 福村拓真
  • Organizer: 第50回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学（愛知県）
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] べん毛輸送装置構成因子FliPペリプラズム領域の構造機能解析 (2012)
  • Author(s): 福村拓真
  • Organizer: 第9回21世紀大腸菌研究会
  • Place of Presentation: 長浜ロイヤルホテル（滋賀県）
  • Year and Date: 2012-06-21
• [Presentation] バクテリアべん毛蛋白質輸送におけるエネルギー産生機構 (2012)
  • Author(s): 南野徹
  • Organizer: 第7回トランスポーター研究会年会
  • Place of Presentation: 京都大学農学部（京都府）
  • Year and Date: 2012-06-09
  • Invited
• [Presentation] Mapping Interactions of FliH with the Flagellar Type III Export Apparatus by Site-Directed Crosslinking (2012)
  • Author(s): Hara, N., et al.
  • Organizer: Gordon Research Conference on Sensory Transduction in Microorganisms
  • Place of Presentation: Ventura Beach Marriott, Ventura, California, USA
• [Presentation] バクテリアベん毛III型蛋白質輸送のエネルギー共役機構 (2011)
  • Author(s): 南野徹
  • Organizer: 第84回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館(京都府)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-21
• [Presentation] 細菌べん毛蛋白質輸送システムの分子機構 (2011)
  • Author(s): 今田勝巳, et al.
  • Organizer: 第84回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館(京都府)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-21
• [Presentation] べん毛蛋白質輸送におけるFIgNシャペロンの役割(Role of a bacterial flagellar chaperone FIgN in flagellar type III protein export) (2011)
  • Author(s): 肥田晢, et al.
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学・姫路書写キャンパス(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-18
• [Presentation] 細菌べん毛蛋白質輸送ゲート複合体はH^+でもNa^+でも駆動されるデュアルフューエルシステムである(Bacterial flagellar type III protein export gate complex is a duel fuel system that utilizes both proton and sodium ion for protein export) (2011)
  • Author(s): 南野徹, et al.
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学・姫路書写キャンパス(兵庫県)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] バクテリアベん毛に特異的な蛋白質輸送システムのエネルギー共役機構 (2011)
  • Author(s): 南野徹
  • Organizer: 名古屋大学大学院理学研究科生命理学専攻セミナー
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-05-20
• [Presentation] Energy transduction mechanism of bacterial Flagellar type III protein export. (2011)
  • Author(s): Minamino, T., et al.
  • Organizer: Gordon Research Conference on Bioenergetics
  • Place of Presentation: Proctor Academy, New Hampshire, USA
• [Remarks]
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/jpn/general/lab/02/
• [Remarks]
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/jpn/general/lab/032/