複合体構造解析によるＡＤＰリボシル化毒素の標的タンパク質認識機構の解明

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121529
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto Sangyo University
• Principal Investigator: 津下 英明 京都産業大学, 公私立大学の部局等, 教授 (40299342)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000); Fiscal Year 2012: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2011: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
• Keywords: 細菌 / ADPリボシル化 / 毒素 / 複合体構造 / アクチン / ホスト認識 / 反応機構 / C3 / RhoA / Ia / モノADPリボシル化 / 複合体結晶構造解析 / 特異性

Outline of Annual Research Achievements

ウェルシュ菌由来の二成分毒素Iota毒素（モノADPリボシル化酵素：Iaサブユニット）はアクチンを標的としてモノADPリボシルを起こし、Arg177を修飾する事でアクチンの重合を阻害し、細胞毒性を示すことが知られている。我々はその機能を理解するために毒素とヒト基質タンパクであるアクチンの複合体の結晶構造を非水解性の基質アナログβTADを挟んで、明らかにしている（Tsuge et al. PNAS 2008)。しかしながら、本来の基質であるNAD＋が結合した状態またモノADPリボシル化の反応が進んだ反応後の構造はわかっていなかった。
今回我々はアポIa-アクチンの複合体の大きな結晶を作成し、結晶を凍結させるべく使用した、エチレングリコールを含んだ母液がモノADPリボシル化反応を抑える事を見いだした。これを利用して結晶をソーキングし、反応の前と後に相当するNAD+-Ia-actinとIa-ADP-ribosylated (ADPR)-actinの複合体結晶構造を高い分解能で明らかにした（1.7 および2.2 オングストローム)。また、反応に重要なアミノ酸E378とE380の点変異体を作り、このNAD+-Ia（mutant)-actinでの結晶構造も明らかにした（Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 12;110(11):4267-72.）。
その反応は、まずNAD+からSn1反応により、ニコチンアミドが切れ、オキソカルベニウムカチオン中間体ができ、さらに第２の中間体を経て、アクチンのアルギニン177に近づき、ADPリボシル化の修飾反応が起きると考えられた。第一中間体では構造的緊張（strain)した状態であり、此れが緩和(alleviation)する事により反応が進むstrain-alleviation　modelを提唱した。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Arginine ADP-ribosylation Mechanism Based on Structural Snapshots of Iota-toxin and Actin Complex. (2013)
  • Author(s): Tsurumura, T., Tsumori, Y., Qiu, H., Oda, M., Sakurai, J., Nagahama, M., Tsuge, H.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. Volume: 110 Issue: 11 Pages: 4267-4272
  • DOI: 10.1073/pnas.1217227110
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structures of dye-decolorizing peroxidase with ascorbic acid and 2,6-dimethoxyphenol. (2012)
  • Author(s): Yoshida T
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 586(24) Pages: 4351-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of sphingomyelinase in infectious diseases caused by Bacillus cereus. (2012)
  • Author(s): Oda M
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 7(6)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of side-edge site of sphingomyelinase from Bacillus cereus. (2012)
  • Author(s): Oda M
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 422(1) Pages: 128-32
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The catalytic mechanism of dye-decolorizing peroxidase DyP may require the swinging movement of an aspartic acid residue (2011)
  • Author(s): Yoshida T, Tsuge H, Konno H, Hisabori T, Sugano Y
  • Journal Title: FEBS.J Volume: 278 Pages: 2387-2394
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure and stability of Gyuba, β-lactoglobulin chimera (2011)
  • Author(s): Ohtomo H, Konuma T, Utsunomiya H, Tsuge H, Ikeguchi M
  • Journal Title: Protein Sci Volume: 20(11) Issue: 11 Pages: 1867-75
  • DOI: 10.1002/pro.720
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis of free reduced flavin generation by flavin reductase from Thermus thermophilus HB8 (2011)
  • Author(s): Imagawa T, Tsurumura T, Sugimoto Y, Aki K, Ishidoh K, Kuramitsu S, Tsuge H
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 286(51) Pages: 44078-44085
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 感染症を理解するための構造生物学 (2013)
  • Author(s): 津下英明
  • Organizer: 細菌学会
  • Place of Presentation: 浦安
  • Year and Date: 2013-03-18
  • Invited
• [Presentation] モノアシルグリセロールリパーゼの二量体形成はその機能に重要か? (2012)
  • Author(s): 鶴村俊治
  • Organizer: 生化学会
  • Place of Presentation: 博多
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] インフルエンザウィルスRNAポリメラーゼPB2のX線結晶構造解析 (2012)
  • Author(s): 秋こう
  • Organizer: 生化学会
  • Place of Presentation: 博多
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] アルギニンADPリボシル化初めての可視化 (2012)
  • Author(s): 津下英明
  • Organizer: ビタミンB研究協議会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2012-11-17
• [Presentation] Actin Recognition and ADP-ribosylation of C. perfringens iota-toxin (2012)
  • Author(s): Hideaki Tsuge
  • Organizer: The 11th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • Place of Presentation: 淡路
  • Year and Date: 2012-09-13
• [Presentation] アクチン ADP リボシル化反応に伴う酵素の構造変化 (2012)
  • Author(s): 鶴村俊治
  • Organizer: タンパク質科学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2012-06-21
• [Presentation] ADPリボシル化反応に伴う酵素の構造変化 (2012)
  • Author(s): 津下英明
  • Organizer: ビタミンB研究協議会
  • Place of Presentation: 京都国際交流会館
  • Year and Date: 2012-02-04
• [Presentation] ADPリボシル化毒素構造研究の最前線 (2011)
  • Author(s): 津下英明
  • Organizer: シンポジウム「疾患治療に用いる天然有機化合物の生合成遺伝子の包括的理解」
  • Place of Presentation: 徳島文理大学(招待講演)
  • Year and Date: 2011-12-22
• [Presentation] アクチンADPリボシル化の構造基盤 (2011)
  • Author(s): 津下英明
  • Organizer: 生化学会
  • Place of Presentation: 京都国際会館(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-21
• [Presentation] 感染症因子とヒトタンパク質の相互作用を見る (2011)
  • Author(s): 津下英明
  • Organizer: X線の会
  • Place of Presentation: 阪急グランドビル(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-10
• [Presentation] ADPリボシル化毒素によるアクチン認識の特異性解析 (2011)
  • Author(s): 鶴村俊治、津下英明
  • Organizer: 日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: 大阪府吹田市
• [Presentation] Crystal structure of Ia-Actin complex with novel ligand (2011)
  • Author(s): Tsurumura T., Tsuge H.
  • Organizer: IUCr(国際結晶学会)
  • Place of Presentation: Madrid Spain
• [Presentation] Structural basis for the Helicobacter pylori-carcinogenic TNF-alpha-inducing protein (2011)
  • Author(s): Tsurumura T., Tsuge H.
  • Organizer: IUCr,(国際結晶学会)
  • Place of Presentation: Madrid Spain
• [Remarks] 米国科学アカデミー紀要（PNAS）でCommentaryが掲載されました
  • URL: http://www.kyoto-su.ac.jp/department/nls/news/20130314_news.html
• [Remarks] 米国科学アカデミー紀要（PNAS）のオンライン版に掲載
  • URL: http://www.kyoto-su.ac.jp/department/nls/news/20130131_news.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/~tsuge/Home_Japanese.html