脊椎動物キネトコア複合体ＣＥＮＰ－ＨＩＫＬＭＮの構造細胞生物学

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121530
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 西野 達哉 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 助教 (50533155)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2012: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2011: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: 酵素反応 / 生物物理 / 走査プローブ顕微鏡 / 分子認識 / 蛋白質 / 操作プローブ顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

本研究申請の目的は癌や細胞分裂に関わる脊椎動物キネトコア構成因子CENP-HIKLMNの構造と機能の関係を明らかにし、これら蛋白質複合体の分子基盤を解明する事にある。

今年度は昨年度の結果を踏まえてCENP-L/CENP-N複合体の結晶化を引き続き行った。全長CENP-L/CENP-N複 合体は発現量が低く、蛋白質の性質も悪いため発現系の改善を行った。大腸菌における発現量増大および可溶性向上のためにマルトース結合蛋白質との融合蛋白質として発現した。その結果、発現量及び可溶性画分が劇的に向上した。このようにして調製した蛋白質の結晶化を千種類程試みたがこれまでのところ結晶化につながるような条件は得られていない。

一方、CENP-L/CENP-N蛋白質複合体と他のキネトコア因子の関係を明らかにする目的でこれまでに分裂酵母において相互作用が報告されているCENP-Cの発現系構築を行った。ニワトリCENP-Cは864アミノ酸より構成されており、N末端にMis12複合体との相互作用領域、中央にCENP-Aヌクレオゾームとの相互作用領域、C-末端に二量体形成ドメインが存在する。このようなCENP-C蛋白質を５つの領域に分断しそれぞれ別個に発現系を構築した。全てマルトース結合蛋白質との融合蛋白質として発現したところ、可溶性の蛋白質として得られた。小スケールにて精製、相互作用解析したところ、C-末端領域が相互作用していた。今後は大規模精製を行って結晶化するとともに相互作用領域をさらに特定するために短いコンストラクトを作成し最小結合領域を特定する。またCENP-L/CENP-N複合体とCENP-Cの解離定数をITC等により測定しその物性を明らかにする。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] "CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly." (2013)
  • Author(s): Nishino T, Rago F, Hori T, Tomii K, Cheeseman IM, Fukagawa T
  • Journal Title: EMBO J Volume: 32 Issue: 3 Pages: 424-36
  • DOI: 10.1038/emboj.2012.348
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 真核生物キネトコア複合体CENP-TWSXの調製、結晶化と立体構造解析 (2013)
  • Author(s): 西野達哉
  • Journal Title: 蛋白質科学会アーカイブ Volume: E070 Pages: 1-11
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] セントロメアの形成に必須なCENP-T-W-S-Xの構造解析 (2013)
  • Author(s): 西野達哉
  • Journal Title: SPring8利用者情報 Volume: 18 Pages: 8-13
• [Journal Article] セントロメア領域に特異的なクロマチン構造 (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Journal Title: 遺伝 Volume: 66 Pages: 552-558
  • NAID: 40019432689
• [Journal Article] "CENP-T-W-S-X Forms a Unique Centromeric Chromatin Structure with a Histone-like Fold." (2012)
  • Author(s): Nishino T, Takeuchi K, Gascoigne, KT, Suzuki A, Hori T, Oyama T, Morikawa K, Cheeseman IM, Fukagawa T
  • Journal Title: Cell Volume: 148 Issue: 3 Pages: 487-501
  • DOI: 10.1016/j.cell.2011.11.061
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] "Spindle microtubules generate tension-dependent changes in the distribution of inner kinetochore proteins." (2011)
  • Author(s): Suzuki A, Hori T, Nishino T, Usukura J, Miyagi A, Morikawa K, Fukagawa T
  • Journal Title: J. Cell Biol Volume: 193 Issue: 1 Pages: 125-140
  • DOI: 10.1083/jcb.201012050
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Structural biology of eukaryotic chromosome segregation machineries (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 第85回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場 （福岡市）
  • Year and Date: 2012-12-14
  • Invited
• [Presentation] 真核生物キネトコア複合体CENP-T天然変性領域の構造生物学的解析 (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 天然変性蛋白質計算科学セミナー
  • Place of Presentation: HOTEL Brush Up (御殿場市)
  • Year and Date: 2012-10-30
  • Invited
• [Presentation] Structural cell biology of chromosome segregation machinery (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 第71回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌 (札幌市)
  • Year and Date: 2012-09-19
  • Invited
• [Presentation] New histone complex at eukaryotic centromere: CENP-T-W-S-X forms a unique chromatin structure (2012)
  • Author(s): Tatsuya Nishino
  • Organizer: Jacques Monod Conferences
  • Place of Presentation: CNRS facilities in Roscoff （ロスコフ) 米国
  • Year and Date: 2012-09-05
  • Invited
• [Presentation] Structural cell biochemistry of a novel histone fold vertebrate kinetochore complex: CENP-TW and CENP-SX form a heterotetramer (2012)
  • Author(s): Tatsuya Nishino
  • Organizer: 12th HFPS Awardees Meeting
  • Place of Presentation: EXCO Exhibition and Convention Centre (テグ市) 韓国
  • Year and Date: 2012-07-01
• [Presentation] 新規セントロメア特異的ヒストン様複合体 CENP-TWSX の構造機能解析 (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 第12回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場 （名古屋市）
  • Year and Date: 2012-06-20
  • Invited
• [Presentation] Elucidation of CCAN involved in eukaryotic chromosome segregation (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: NIG retreat
  • Place of Presentation: 箱根プリンスホテル (箱根町)
  • Year and Date: 2012-04-24
• [Presentation] 真核生物キネトコア構成因子CENP-TWSX複合体の構造と機能 (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 第29回染色体ワークショップ
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2012-01-26
• [Presentation] 真核生物染色体分配装置の構造生物学 (2012)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 2012年度PERI/BERI OBOG会
  • Place of Presentation: 目白クラブ （東京）
  • Invited
• [Presentation] Vertebrate kinetochore structure and function (2012)
  • Author(s): Tatsuya Nishino
  • Organizer: Kim Nasmyth Symposium
  • Place of Presentation: オックスフォード大学 (オックスフォード） イギリス
  • Invited
• [Presentation] Structural cell biochemistry of a novel histone fold vertebrate kinetochore complex : CENP-TW and CENP-SX form a heterotetramer (2011)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 2011 American Society for Cell Biology
  • Place of Presentation: Colorado, USA
  • Year and Date: 2011-12-06
• [Presentation] 脊椎動物キネトコア因子CENP-TWSXの構造と機能 (2011)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 第6回構造エピゲノムワークショップ
  • Place of Presentation: 横浜(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-20
• [Presentation] Structural cell biochemistry of a novel histone fold vertebrate kinetochore complex (2011)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 2011 Gordon conference on Chromosome dynamics
  • Place of Presentation: Vermont, USA
  • Year and Date: 2011-07-12
• [Presentation] 脊椎動物動原体構成因子CENP-S/X,CENP-T/W複合体の構造細胞生化学と溶液動態解析 (2011)
  • Author(s): 西野達哉
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2011-06-08
• [Remarks] 国立遺伝学研究所 分子遺伝研究部門 ニュース
  • URL: http://www.nig.ac.jp/labs/MolGene/news_j.html
• [Remarks] 国立遺伝学研究所 研究成果
  • URL: http://www.nig.ac.jp/Research-Highlights.html?research_tags=2013
• [Remarks]
  • URL: http://www.nig.ac.jp/Research-Highlights/992/999.html
• [Remarks]
  • URL: http://first.lifesciencedb.jp/archives/4350#more-4350