ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＡＧＯ２様活性を有するＲＮＰ複合体の構造機能解析

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121535
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 沼田 倫征 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (10401564)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2012: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2011: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
• Keywords: CRISPR / crRNA / Cas / リボ核タンパク質複合体 / RNAサイレンシング / 結晶構造解析 / 古細菌 / Cmrタンパク質 / RNA / タンパク質 / 遺伝子サイレンシング / X線結晶構造解析 / 原核生物

Outline of Annual Research Achievements

Cmrエフェクター複合体は6種のCmrタンパク質（Cmr1-6）とcrRNAから構成されたリボ核タンパク質複合体である。発現・精製したタンパク質サブユニットを用いて、分子間相互作用を検討した結果、Cmr2とCmr3が相互作用することを明らかにした。次に、Cmr2-Cmr3複合体の結晶化を試みた結果、15%イソプロパノール、20 mM MgCl2、50 mM MES (pH 6.0)を含む条件で単結晶を得た。大型放射光施設フォトンファクトリーにて回折実験を行い、2.5～2.6Å分解能の回折データを収集した。Cmr2の結晶構造はすでに報告されており、Cmr2をサーチモデルとした分子置換法によって複合体の結晶構造を決定した。Cmr2-Cmr3複合体の結晶構造を解析した結果、分子境界付近に大きなクレバスが存在することが明らかとなった。また、本研究ではATPもしくは3’-AMPと結合したCmr2-Cmr3複合体の結晶構造を決定しており、これらヌクレオチドはクレバスの奥深くに結合していることが明らかとなるとともに、ヌクレオチド結合部位が少なくとも2か所存在することが判明した。また、Cmr3の立体構造はCas6と類似していることが分かった。Cas6はpre-crRNAのプロセシングに関わる酵素であり、Cas6に特有のくぼみ領域を用いてpre-crRNAの5’側に位置するssRNA領域と結合する。興味深いことに、Cmr3にもプラスにチャージしたくぼみ領域が存在し、それはクレバス形成に関わることが分かった。したがって、Cmr2-Cmr3に見られるクレバスはssRNAと相互作用することが推定され、結合していたヌクレオチドはssRNAの各ヌクレオチド残基をミミックしたものであることが推定された。Cmr2-Cmr3はssRNAと結合することから、このクレバスにssRNAが結合すると示唆される。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure of the Cmr2-Cmr3 subcomplex in the CRISPR-Cas RNA silencing effector complex (2013)
  • Author(s): Osawa, T., Inanaga, H. and Numata, T.
  • Journal Title: J. Mol. Biol. Volume: 425 Issue: 20 Pages: 3811-3823
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.03.042
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biogenesis of 2-agmatinylcytidine catalyzed by the dual protein and RNA kinase TiaS (2011)
  • Author(s): Terasaka N., Kimura S., Osawa T., Numata T., Suzuki T.
  • Journal Title: Nature Structural & Molecular Biology Volume: 18 Issue: 11 Pages: 1268-1274
  • DOI: 10.1038/nsmb.2121
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis of tRNA agmatinylation essential for AUA codon decoding (2011)
  • Author(s): Osawa T., Kimura S., Terasaka N., Inanaga H., Suzuki T.
  • Journal Title: Nature Structural & Molcular Biology Volume: 18 Issue: 11 Pages: 1275-1280
  • DOI: 10.1038/nsmb.2144
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of an archaeal tRNA-modification enzyme, TiaS, complexed with tRNAIle2 and ATP (2011)
  • Author(s): Osawa, et al
  • Journal Title: Acta Crystallogr.Sect.F Volume: 67 Pages: 1414-1416
  • Peer Reviewed