ファージの重複感染シグナルがもたらす溶菌阻止現象の分子メカニズムの解明

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121538
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 金丸 周司 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (50376951)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2012: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: バクテリオファージ / 溶菌阻止 / 結晶構造解析 / 蛋白質間相互作用 / 超遠心分析 / ホーリン / アンチホーリン / SEC-MALS

Outline of Annual Research Achievements

1.gpT-62CTDの発現・精製
gpTのC末端側のペリプラズムドメイン(CTD)のN末端にpelBのシグナル配列を付加したgpT-CTDは精製過程で62残基目のリジンで一部切断が起きていることが確認された。そこで、gpTの残基目のリジンからC末端側のペリプラズムドメイン(62CTD)のN末端にpelBのシグナル配列を付加したgpT-62CTDの大腸菌における大量発現系を構築した。gpT-CTDと同様に不溶性各分として回収されたgpT-62CTDは、pH9.5, 1.2Mアルギニンの条件で可溶化することに成功した。
2. gpT-62CTD, gpRI-CTD複合体の結晶化
pH9.5, 1.2Mアルギニンの条件で可溶化したgpT-62CTDに精製したgpRI-CTDを添加しその後アルギニンを透析により徐々に除くことにより、gpT-62CTD_gpRI-CTD複合体を得ることに成功した。超遠心分析によりこの精製標品は溶液中で2：2の複合体とその重合体が平衡して存在することが示された。また、pHを9.5からpH7.5にすると、2：2の複合体が3量化しているもののみが存在することが分かった。さらに、この複合体について結晶化を試み、gpT-CTD_gpRI-CTD複合体とは異なった条件で結晶化に成功した。
3. gpT-62CTD, gpRI-CTD複合体の結晶構造解析
gpT-62CTD_gpRI-CTD複合体の結晶構造解析に成功し、2.4Å分解能の複合体の結晶構造を得ることができた。その結果、溶液中の基本単位の2：2の複合体と思われるユニットを結晶中に見出すことができた。また、gpRIはgpTの周囲の3か所に結合しgpTの重合を阻害していることが示唆された。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The molecular architecture of the bacteriophage T4 neck (2013)
  • Author(s): Fokine A, Zhang Z, Kanamaru S, Bowman VD, Aksyuk AA, Arisaka F, Rao VB, Rossmann MG.
  • Journal Title: J Mol Biol Volume: 425(10) Issue: 10 Pages: 1731-44
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.02.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of Cex1p reveals the mechanism of tRNA trafficking between nucleus and cytoplasm (2013)
  • Author(s): Nozawa K, Ishitani R, Yoshihisa T, Sato M, Arisaka F, Kanamaru S, Dohmae N, Mangroo D, Senger B, Becker HD, Nureki O
  • Journal Title: Nucleic Acids Res Volume: 41 Pages: 3901-3914
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Acetophenone reductase with extreme stability against a high concentration of organic compounds or an elevated temperature (2013)
  • Author(s): Yamamoto T, Nakata Y, Cao C, Sugiyama Y, Asanuma Y, Kanamaru S, Matsuda T
  • Journal Title: Appl Microbiol Biotechnol Volume: Epub ahead of print
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Semi-synthesis of an artificial scandium (III) enzyme with a β-helical bio-nanotube (2012)
  • Author(s): H. Inaba, S. Kanamaru, F. Arisaka, S. Kitagawa and T. Ueno
  • Journal Title: Dalton Transactions Volume: 41 Issue: 37 Pages: 11424-11427
  • DOI: 10.1039/c2dt31030a
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallographic analysis reveals octamerization of viroplasm matrix protein P9-1 of Rice black streaked dwarf virus (2012)
  • Author(s): Akita F, Higashiura A, Shimizu T, Pu Y, Suzuki M, Uehara-Ichiki T, Sasaya T, Kanamaru S, Arisaka F, Tsukihara T, Nakagawa A, Omura T
  • Journal Title: J Virol Volume: 86(2) Issue: 2 Pages: 746-756
  • DOI: 10.1128/jvi.00826-11
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Screw motion regulates multiple functions of T4 phage protein gene product 5 during cell puncturing (2011)
  • Author(s): Nishima W, Kanamaru S, Arisaka F, Kitao A
  • Journal Title: J Am Chem Soc Volume: 133(34) Issue: 34 Pages: 13571-13576
  • DOI: 10.1021/ja204451g
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dual modification of a triple-stranded β-helix nanotube with Ru and Re metal complexes to promote photocatalytic reduction of CO(2) (2011)
  • Author(s): Yokoi N, Miura Y, Huang CY, Takatani N, Inaba H, Koshiyama T, Kanamaru S, Arisaka F, Watanabe Y, Kitagawa S, Ueno T
  • Journal Title: Chem Commun (Camb) Volume: 47(7) Issue: 7 Pages: 2074-2076
  • DOI: 10.1039/c0cc03015e
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] コンポジション・グラジエント法を用いた多角度光散乱装置による分子間相互作用解析 (2011)
  • Author(s): 金丸周司
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume: 89 Pages: 378-380
• [Presentation] バクテリオファージT4近位尾繊維gp34C末端フラグメントの結晶構造解析 (2012)
  • Author(s): 第85回日本生化学会大会
  • Organizer: 金丸 周司
  • Place of Presentation: マリンメッセ福岡（福岡県）
  • Year and Date: 2012-12-14
• [Presentation] 環形動物斜紋筋のコネクチン様4000K タンパク質の47 アミノ酸リピート (2012)
  • Author(s): 第50回日本生物物理学会年会
  • Organizer: Yui Nomiya
  • Place of Presentation: 名古屋大学・東山キャンパス（愛知県）
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] SlyD 融合による人工三本鎖ベータへリックスの可溶化の試み (2012)
  • Author(s): 第50回日本生物物理学会年会
  • Organizer: Kaname Nishijo
  • Place of Presentation: 名古屋大学・東山キャンパス（愛知県）
  • Year and Date: 2012-09-22
• [Presentation] T4ファージの溶菌と溶菌阻止 (2012)
  • Author(s): 第4回ファージ研究会
  • Organizer: 金丸 周司
  • Place of Presentation: 群馬大学・刀城会館（群馬県）
  • Year and Date: 2012-09-19
• [Presentation] T4ファージ基盤ウェッジ形成におけるウェッジ構成蛋白質の相互作用部位の同定 (2012)
  • Author(s): 第4回ファージ研究会
  • Organizer: 伊藤 豪
  • Place of Presentation: 群馬大学・刀城会館（群馬県）
  • Year and Date: 2012-09-19
• [Presentation] T4ファージの溶菌関連蛋白質ホーリン・アンチホーリンの相互作用解析 (2012)
  • Author(s): 第4回ファージ研究会
  • Organizer: 伊藤 悠太
  • Place of Presentation: 群馬大学・刀城会館（群馬県）
  • Year and Date: 2012-09-19
• [Presentation] 病原性大腸菌のタイプ6分泌系のVgrG蛋白質のX線結晶構造解析に向けた大量発現系の構築と性状 (2012)
  • Author(s): 第4回ファージ研究会
  • Organizer: 内田 一也
  • Place of Presentation: 群馬大学・刀城会館（群馬県）
  • Year and Date: 2012-09-19
• [Presentation] PP01ファージ尾繊維先端を形成するgp37C-gp38複合体の発現系の構築と性状解析 (2012)
  • Author(s): 第4回ファージ研究会
  • Organizer: 西條 要
  • Place of Presentation: 群馬大学・刀城会館（群馬県）
  • Year and Date: 2012-09-19
• [Presentation] T4ファージ基盤終結蛋白質gp48のSlyD融合蛋白質発現系の構築と結晶化の試み (2012)
  • Author(s): 第4回ファージ研究会
  • Organizer: 新司 雄也
  • Place of Presentation: 群馬大学・刀城会館（群馬県）
  • Year and Date: 2012-09-19
• [Presentation] The trimeric core structure of the proximal end of the long tail fiber, gp34 of bacteriophage T4 (2012)
  • Author(s): EMBO Conference, Viruses of Microbes
  • Organizer: Shuji Kanamaru
  • Place of Presentation: Royal Military Academy, Brussels, Belgium
  • Year and Date: 2012-07-16
• [Presentation] Specific inhibition mechanism of gp5 lysozyme by spackle protein from bacteriophage T4 (2012)
  • Author(s): EMBO Conference, Viruses of Microbes
  • Organizer: Kazuya Uchida
  • Place of Presentation: Royal Military Academy, Brussels, Belgium
  • Year and Date: 2012-07-16
• [Presentation] T4ファージgp5-Lyz_Sp 複合体のX 線結晶構造解析によるSpackle 蛋白質のgp5リゾチーム阻害メカニズムの解明 (2012)
  • Author(s): 第12回日本蛋白質科学会年会
  • Organizer: 内田 一也
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県）
  • Year and Date: 2012-06-20
• [Presentation] T4ファージ尾繊維蛋白質gp34 の三量体コア構造の解明 (2012)
  • Author(s): 第12回日本蛋白質科学会年会
  • Organizer: 金丸 周司
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県）
  • Year and Date: 2012-06-20
• [Presentation] コンポジション・グラジエント法を用いた多角度光散乱装置による分子間相互作用解析 (2012)
  • Author(s): 金丸周司
  • Organizer: 第1回生体分子相互作用解析フォーラムワークショップ
  • Place of Presentation: ベックマンコールター本社(招待講演)
  • Year and Date: 2012-03-10
• [Presentation] T4ファージSpsckle蛋白質によるgp5テイルリゾチームの溶菌阻害メカニズム (2011)
  • Author(s): 内田一也、金丸周司、有坂文雄
  • Organizer: 第10回微生物研究会
  • Place of Presentation: 千葉大学松戸キャンパス
  • Year and Date: 2011-11-12
• [Presentation] Protein-protein interaction analysis by composition gradient multiangle light scattering (CG-MALS) (2011)
  • Author(s): 金丸周司
  • Organizer: 第11回蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク(招待講演)
• [Presentation] T4ファージgp7C末端フラグメントの基盤ウェッジ形成における役割 (2011)
  • Author(s): 伊藤豪、金丸周司、有坂文雄
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学・姫路書写キャンパス
• [Presentation] T4ファージのアンチホーリンによるホーリンの凝集抑制と溶菌阻止メカニズム (2011)
  • Author(s): 伊藤悠太、金丸周司、有坂文雄
  • Organizer: 第84回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
• [Presentation] Crystal structure reveals how spackle protein (gp61.3) inhibits lysozyme activity of gp5 tail lysozyme from bacteriophage T4 (2011)
  • Author(s): Shuji Kanamaru
  • Organizer: XXIInd Biennial Conference on Phage/Virus Assembly
  • Place of Presentation: The Marine Sciences Institute