バーチャル単一細胞ゲノムシーケンス法による姉妹染色分体の分配と組み換えの解析

• Project Area: Systematic study of chromosome adaptation
• Project/Area Number: 23125501
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 伊藤 隆司 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90201326)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥11,700,000 (Direct Cost: ¥9,000,000、Indirect Cost: ¥2,700,000); Fiscal Year 2012: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000); Fiscal Year 2011: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
• Keywords: 単一細胞解析 / 非対称細胞分裂 / 姉妹染色体分体組み換え / 不死鎖説 / 出芽酵母 / 幹細胞 / AID / マイクロマニピュレーション / 次世代シーケンサ

Outline of Annual Research Achievements

本研究では姉妹染色分体の挙動を追跡するために、以下の手順に沿った解析を計画した。①DNAシチジンデアミネースAID (Cを脱アミノ化してUに変換)とウラシルDNAグライコシレースUNG1(DNA中のUを修復)の発現を相互排他的に誘導・抑制できる酵母株を構築する。②①の株をAIDの発現が誘導されUNG1の発現が抑制される条件(AID+/UNG1－)の寒天培地上に散布し、DNA鎖の随所にC→Uの変換を誘導する。③②の状態での複製により姉妹染色分体間に微細な配列の差異を導入する。④出芽直後に母細胞と娘細胞をマイクロマニピュレータで分離して、AIDの発現が抑制されてUNG1の発現が誘導される条件(AID－/UNG1+)の培地に移す。⑤④の状態で十分に増殖させた両細胞のゲノム配列を決定する。親細胞のWatson鎖およびCrick鎖に由来する娘細胞のゲノム領域は、親細胞の元来の配列(参照配列)に対してそれぞれC-TおよびG-Aのミスマッチを示す。この性質を利用して分配様式を明らかにし、組み換え部位を特定する。
上記の目的を実現するために前年度に構築した酵母株（FY1679-28C, ung1-delta::KanMX, URA3::GAL1pr-Flag-UNG1, LEU2::MET17pr-GFP-Flag-hAID）を用いて、カナバニン抵抗性を指標に変異率の検討を行なった上で、全ゲノムシーケンスを行ったが、期待されたC-T変異（或いはG-A変異）の上昇が認められなかった。
一方で、mcm4-chaosアレルと野生型MCM4アレルの発現スイッチングによるゲノム不安定性についても解析を進めたが、報告されているような表現型の変化が認められなかった。最近、この現象が２倍体に特異的であることが報告されたため、２倍体株を作成して表現型の確認を行い、ゲノムシーケンスを予定している。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。