血球細胞の活性酸素産生における多階層制御：分子構造変化からホメオスタシスへ

• Project Area: Establishment of Integrative Multi-level Systems Biology and its Applications
• Project/Area Number: 23136510
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤原 祐一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20532980)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000); Fiscal Year 2012: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2011: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: イオンチャネル / レドックス / プロトンチャネル / 血球細胞

Outline of Annual Research Achievements

活性酸素産生制御に関わる電位依存性H+チャネル(VSOP)をターゲットに多階層に渡る定量的解析を行った。
(1) 構造レベル：VSOPは2量体として機能する。VSOPの膜貫通領域にCys残基を導入し、酸化剤による架橋を生化学的に解析した。これにより、VSOPの２つのサブユニットが膜貫通領域で近接する部位を明らかにした。これにより、VSOPチャネルは2量体間で機能的連携を行なうことが可能となる。
(2) 構造機能レベル：VSOP細胞内コイルドコイルが酸化／還元に応答して会合／解離することを見いだし、酸化還元に応答するコイルドコイルの構造を、H2O2またはDTT存在化で、結晶構造解析を行った。得られた結晶構造を基に、酸化還元に応答するイオンチャネルの電気生理学的な解析を行なった。
(3) 分子レベル：VSOPの2量体化を担うコイルドコイルドメインと、膜貫通領域との分子内機能連携を解析するため、2つの部分をつなぐリンカーの変異体を網羅的に作成し、電気生理学的性質を解析した。リンカー部分のアミノ酸残基の数とVSOPチャネルの活性化キネティクスのスピードの相関はヘリックスの周期性を呈し、この二つの領域はヘリックスでリンクしていることを明らかにした。
(4) 細胞レベル： 正常マウス、VSOPノックアウトマウスのそれぞれから好中球を単離し、O2-、H2O2、HOCl（好中球のみ）などの活性酸素のレベルを定量化する実験を行った。ノックアウトマウスでは活性酸素産生レベルが減弱し、さらに産生しすぎないようにするフィードバック機構の破綻も明らかにした。
(5)個体レベル：ノックアウトマウスに対して感染実験を行ない、カンジダ真菌に対する抵抗力の減弱を明らかにした（連携研究者の大河内助教と連携）。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Gating of the Designed Trimeric/Tetrameric Voltage-Gated H+ Channel (2013)
  • Author(s): Fujiwara Y., Kurokawa T., Takeshita K., Nakagawa A., Larsson HP., Okamura Y.
  • Journal Title: Journal of Physiology Volume: 591 Issue: 3 Pages: 627-640
  • DOI: 10.1113/jphysiol.2012.243006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The cytoplasmic coiled-coil mediates cooperative gating temperature sensitivity in the voltage-gated H+ channel Hv1 (2012)
  • Author(s): Fujiwara Y, Kurokawa T, Takeshita K, Kobayashi M, Okochi Y, Nakagawa A & Okamura Y
  • Journal Title: Nat. Communi. Volume: 3 Issue: 1 Pages: 816-816
  • DOI: 10.1038/ncomms1823
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the cytoplasmic PTEN-like region of Ci-VSP provides insight into substrate specificity and redox regulation of the phosphoinositide phosphatase activity (2011)
  • Author(s): Matsuda M, Takeshita K, Kurokawa T, Sakata S, Suzuki M, Yamashita E, Okamura Y, Nakagawa A
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 286 Pages: 23368-77
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Regulatory roles of the dimeric structure in the voltage-gated H+ channel (2013)
  • Author(s): 藤原祐一郎、黒川竜紀、竹下浩平、小林恵、中川敦史、岡村康司
  • Organizer: 第90回 日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 東京、タワーホール船堀
• [Presentation] 生理学者養成と多分野交流 (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎
  • Organizer: 第89回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 松本文化会館(長野県)(招待講演)
  • Year and Date: 2012-03-31
• [Presentation] 3,4量体型へ人工的にデザインした電位依存性プロトンチャネル (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎、黒川竜紀、岡村康司
  • Organizer: 第89回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 松本文化会館(長野県)
  • Year and Date: 2012-03-29
• [Presentation] Gating of Trimerized or Tetramerized Voltage-Gated H+ Channels (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎, マルタペレス, 黒川竜紀, ピータラルソン, 岡村康司
  • Organizer: 第55回生物物理学会大会(米国)
  • Place of Presentation: サンディエゴ(米国)
  • Year and Date: 2012-02-29
• [Presentation] Cytoplasmic Coiled-Coil Mediates the Gating Coupling and the Temperature Sensitivity in the Voltage-gated H+ Channel (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎、黒川竜紀、竹下浩平、小林恵、中川敦史、岡村康司
  • Organizer: HD Physiology国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 東大武田ホール(東京)
  • Year and Date: 2012-01-21
• [Presentation] 電位依存性プロトンチャネルのゲーティングを制御する分子機構 (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎、黒川竜紀、竹下浩平、中川敦史、岡村康司
  • Organizer: 生理研研究所「温熱生理研究会」
  • Place of Presentation: 愛知、生理学研究所
  • Invited
• [Presentation] 電位依存性H+チャネルのゲーティングと構造基盤 (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎、黒川竜紀、岡村康司
  • Organizer: 生理研研究会「膜機能分子の機能・構造ゆらぎの時空間スペクトル解析」
  • Place of Presentation: 愛知、生理学研究所
• [Presentation] 電位依存性H+チャネルの二量体化による活性制御とその構造基盤 (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎
  • Organizer: 第3回 神経科学と構造生物学の融合研究会
  • Place of Presentation: 大阪、大阪大学 蛋白質研究所
  • Invited
• [Presentation] 電位依存性プロトンチャネルの2量体会合はチャネルの温度感受性を制御する (2011)
  • Author(s): 藤原祐一郎、黒川竜紀、竹下浩平、小林恵、中川敦史、岡村康司
  • Organizer: 第10回蛋白質科学会大会
  • Place of Presentation: 阪急エキスポ(大阪府)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-06-09
• [Book] 脳科学辞典（電子書籍） 分担執筆 「膜電位センサー」 (2012)
  • Author(s): 藤原祐一郎、岡村康司
  • Publisher: 理化学研究所
• [Remarks] 電位依存性H+チャネル2量体会合領域の結晶構造とその機能的意義（日本生理学会HP）
  • URL: http://physiology.jp/exec/page/page20120517165828/
• [Remarks] 電位依存性H+チャネルの最適に設計された2量体構造と機能（日本生理学会HP）
  • URL: http://physiology.jp/exec/page/stopics84/
• [Remarks] 体温をあげて細菌から身を守る仕組みがわかった(SPring-8広報)
  • URL: http://www.spring8.or.jp/ja/news_publications/research_highlights/no_67/
• [Remarks] 水素イオンを通すタンパク質がペアで働く仕組みを原子レベルで解明！ (大阪大学HP)
  • URL: http://www.osaka-u.ac.jp/ja/news/ResearchRelease/2012/05/20120509_1
• [Remarks] 水素イオンを通すタンパク質がペアで働く仕組みを原子レベルで解明！(SPring-8HP)
  • URL: http://www.spring8.or.jp/ja/news_publications/press_release/2012/120509
• [Remarks]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/phys2/okamura/index.html