Active involvement of astrocytes in GABA synaptic function and its disruption: spatiotemporal dynamics and pathophysiology

• Project Area: Glia decoding: deciphering information critical for brain-body interactions
• Project/Area Number: 23H04159
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 特命研究教授 (50254272)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2024: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2023: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: NKCC1 / アストロサイト / GABA / てんかん / KCC2

Outline of Research at the Start

GABAシナプス機能におけるアストロサイトの役割を根本的に見直し、GABAシナプス伝達においてCl-ホメオダイナミクスを介して極めて重要な何らかの能動的機能を持つと考え、 GABAシナプス間隙へのCl-補填などClホメオダイナミクスと、GABAの合成／放出／取り込みなど、ニューロンへの能動的関与でGABA作動性抑制性シナプス機能にどのような変化をもたらすのかを明らかにする。すなわち、アストロサイトによるシナプス間隙への細胞外Cl-の補填による神経細胞のCl-電気化学勾配の維持機構と、GABA合成とシナプス後細胞への放出機構のデコーディングを提案する。

Outline of Annual Research Achievements

１．GABAシナプス伝達の興奮転化へのアストロサイトNKCC1関与の証明：アストロサイト選択的にNKCC1を消去したALDH1L1-Cre::NKCC1-flox/floxマウスを用い、アストロサイトのGABA応答が細胞内Cl-濃度上昇であること、すなわちアストロがシナプス間隙へCl-を供給できないことを確認した。このとき、錐体細胞でのGABA作用逆転による後発射の閾値は低下し持続は延長した。アストロサイトのNKCC1がニューロンのCl-ホメオダイナミクスに能動的に働くことを証明した。
２． てんかん原性獲得モデルにおけるアストロサイトNKCC1の生理病態機能解析：ALDH1L1-Cre::NKCC1-flox/floxマウスでピロカルピン腹腔内投与による急性てんかんモデルを作成した。けいれん発作の潜時は有意に短縮し、また、けいれん重積や死亡等の発作重篤度も増し、明らかな易けいれん性を呈していた。アストロサイトのNKCC1がけいれん発作の抑制に働いていることを証明した。
３． GABAシナプスの興奮転化へのアストロサイトイトNKCC1関与機序の解明：以上から、ニューロンから放出されたGABAにアストロサイトがGABAA受容体を介してシナプス間隙へCl-を供給することで、シナプス後細胞のCl-濃度勾配の急激な破綻に対して防護的に働くこと考えられた。これらのCl-動態を直接可視化するため、テタヌス刺激中のニューロンとアストロサイトでの同時Cl-イメージングを試みたが、技術的困難さから結論的な結果には至らなかった。しかしながら、アストロサイトのNKCC1がニューロンのCl-ホメオダイナミクスに能動的作用をもたらすことは証明できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

シナプス間隙へのCl-の供給（野生型でのアストロサイトの[Cl-]i低下、ニューロンでは増加がKOではアストロサイトの[Cl-]i低下が消失）を直接可視化することはできなかったものの、アストロサイト選択的NKCC1を消去したALDH1L1-Cre::NKCC1-flox/floxマウスを独自に作成し、ニューロンから放出されたGABAにアストロサイトがGABAA受容体を介してシナプス間隙へCl-を供給することで、シナプス後細胞のCl-濃度勾配の急激な破綻に対して防護的に働くことを証明できた。シナプス間隙のCl-を低下させるニューロンのKCC2変化の検討は次年度とした。

Strategy for Future Research Activity

１．GABAシナプスの興奮転化へのアストロサイトNKCC1関与の機序の解明：ニューロンから放出されたGABAにアストロサイトがGABAA受容体を介してシナプス間隙へCl-を供給することで、シナプス後細胞のCl-濃度勾配の急激な破綻に対して防護的に働くという我々の仮説を、ALDH1L1-Cre::NKCC1-flox/floxマウスを用いてさらに検討する。ニューロンのNKCC1を阻害してシナプス後細胞のCl-濃度勾配を戻した場合の後発射がどうなるか観察し仮説を証明する。
２．てんかん原性獲得モデルを用いたニューロンNKCC1標的治療の評価： Bumetanideの臨床治験に疑問が残る理由が、ニューロンだけでなくアストロサイトのNKCC1も抑えてしまった結果である可能性を検討するため、KOでbumetanideでニューロンのNKCC1 だけを追加抑制した場合を検討する。また、てんかん原性獲得モデルでのニューロンとアストロサイトでのGABAの変化も確認する。
３．ニューロン興奮性へのアストロサイトNKCC1関与のインビボ2光子イメージング解析:アストロサイトにCa2+センサー（RCamP）を発現するマウスに、シナプシンプロモーターのAAVによりさらにGCaMP6を神経細胞に発現させ、ピロカルピンによるてんかん原生誘導を行って、神経細胞集団とアストロサイトの活動を２光子顕微鏡によるCa2+イメージングで解析する。ALDH1L1-Cre::NKCC1-flox/floxマウスでも同様の観察を行い、アストロサイトのNKCC1が、アストロサイトと神経細胞集団の活動相関に与える影響を明らかにする。ニューロンのKCC2持続脱リン酸化マウスではシナプス間隙Cl-増加が起こると考え、てんかん原生への影響を同様に観察する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Yale School of Medicine(米国)
• [Int'l Joint Research] マインツ大学(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] INSERM(フランス)
• [Journal Article] Early establishment of chloride homeostasis in CRH neurons is altered by prenatal stress leading to fetal HPA axis dysregulation (2024)
  • Author(s): Watanabe Miho、Sinha Adya Saran、Shinmyo Yohei、Fukuda Atsuo
  • Journal Title: Frontiers in Molecular Neuroscience Volume: 17 Pages: 1373337-1373337
  • DOI: 10.3389/fnmol.2024.1373337
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Astrocytic NKCC1 inhibits seizures by buffering Cl- and antagonizing neuronal NKCC1 at GABAergic synapses (2023)
  • Author(s): Nguyen Trong Dao、Ishibashi Masaru、Sinha Adya Saran、Watanabe Miho、Kato Daisuke、Horiuchi Hiroshi、Wake Hiroaki、Fukuda Atsuo
  • Journal Title: Epilepsia Volume: 64 Issue: 12 Pages: 3389-3403
  • DOI: 10.1111/epi.17784
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Tubulin Polyglutamylation by TTLL1 and TTLL7 Regulate Glutamate Concentration in the Mice Brain (2023)
  • Author(s): Ping Yashuang、Ohata Kenji、Kikushima Kenji、Sakamoto Takumi、Islam Ariful、Xu Lili、Zhang Hengsen、Chen Bin、Yan Jing、Eto Fumihiro、Nakane Chiho、Takao Keizo、Miyakawa Tsuyoshi、Kabashima Katsuya、Watanabe Miho、Kahyo Tomoaki、Yao Ikuko、Fukuda Atsuo、Ikegami Koji、Konishi Yoshiyuki、Setou Mitsutoshi
  • Journal Title: Biomolecules Volume: 13 Issue: 5 Pages: 784-784
  • DOI: 10.3390/biom13050784
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dual action of serotonin on local excitatory and inhibitory neural circuits regulating the corticotropin‐releasing factor neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (2023)
  • Author(s): Sato Takayuki、Sugaya Takuma、Talukder Ashraf Hossain、Tsushima Yuki、Sasaki Shotaro、Uchida Katsuya、Sato Tatsuya、Ikoma Yoko、Sakimura Kenji、Fukuda Atsuo、Matsui Ko、Itoi Keiichi
  • Journal Title: Journal of Neuroendocrinology Volume: 35 Issue: 12
  • DOI: 10.1111/jne.13351
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Maternal taurine as a modulator of Cl? homeostasis as well as of glycine/GABAA receptors for neocortical development (2023)
  • Author(s): Furukawa Tomonori, Fukuda Atsuo
  • Journal Title: Frontiers in Cellular Neuroscience Volume: 17 Pages: 1221441-1221441
  • DOI: 10.3389/fncel.2023.1221441
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] アストロサイトNKCC1によるCl bufferingとGABAシナプス抑制への能動的関与. (2023)
  • Author(s): 福田敦夫
  • Organizer: 第6回グリアデコード領域会議
• [Presentation] Therapeutic effects of KCC2 chloride ion transporter activation on detrusor overactivity in mice with spinal cord injury. (2023)
  • Author(s): Watanabe K, Ishibashi M, Suzuki T, Otsuka A, Yoshimura N, Miyake H, Fukuda A.
  • Organizer: AUA (American Urological Association)2023
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Detrusor overactivity is associated with decreased expression of KCC2 chloride ion transporter in mice with spinal cord injury (2023)
  • Author(s): Watanabe K, Ishibashi M, Suzuki T, Otsuka A, Yoshimura N, Miyake H, Fukuda A.
  • Organizer: 第110回日本泌尿器科学会総会
• [Presentation] SLC12A5 dependent disorders, a new challenge for clinic and research. (2023)
  • Author(s): Fukuda A.
  • Organizer: SLC12A5 - NDD SYMPOSIUM
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 浜松医大プレスリリース（Epilepsiaへ研究成果公表）
  • URL: https://www.hama-med.ac.jp/topics/2023/29363.html
• [Remarks] 日本生理学会ホームページ サイエンストピックスNo.168
  • URL: http://physiology.jp/science-topic/29742/
• [Remarks] 日本生理学会ホームページサ イエンストピックスNo.172
  • URL: http://physiology.jp/science-topic/30349/