プロテオーム変化を介した植物の気温変動へのレジリエンス機構の解明

• Project Area: Multi-layered regulatory system of plant resilience under fluctuating environment
• Project/Area Number: 23H04193
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Institute of Science Tokyo
• Principal Investigator: 城所 聡 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (70588368)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2024: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
• Keywords: 植物 / 温度ストレス応答 / ゲノム編集ツール / 温度ストレス / ゲノム編集

Outline of Research at the Start

植物が生命を脅かす気温変化(低温・高温ストレス)に晒されると、耐性遺伝子の発現を急速に誘導することでストレスを耐え凌ぐレジリエンス機構を持つ。これまでに、常温時に概日時計で働く転写因子群が低温・高温ストレス時の遺伝子発現誘導を制御すること、またストレスに応答した翻訳後制御を受けることを明らかにしてきた。そこで本計画研究では、ゲノム編集ツールを組み合わせたプロテオミクス解析やイメージング技術を用いて、概日時計転写因子が常温・低温・高温においてそれぞれの標的遺伝子の発現を制御する分子機構を解析することで、不均一な温度環境において植物が成長とストレス耐性とを柔軟に切り替えるメカニズムの解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

常温・低温・高温におけるRVE転写因子の標的プロモーター上で起こる転写制御の分子機構を明らかにするため、温度への応答性が異なる4つのRVE4/RVE8標的遺伝子のプロモーター内において4~6種類のgRNAを設計した。各gRNAとともdCas9と転写活性化因子をシロイヌナズナプロトプラスト内で一過的に発現させ、標的プロモーターの転写活性を測定した。その結果、それぞれのプロモーターにつき1~2種類のgRNAで高い転写活性化能が見られた。また活性が見られた2種類のgRNAを同時に発現させて同様の実験を行った結果、転写活性化能の相乗的な向上が見られた。
次に、各プロモーターにおいて転写活性化能が見られたgRNAと3×FLAG-dCas9を発現するシロイヌナズナ植物体を作出した。また複数のgRNAをtRNA-Glyで繋ぐことで同時に発現させた3×FLAG-dCas9形質転換体も作出した。さらにMS2アプタマー融合型gRNAおよびSunTagシステムを用いて1分子のgRNA-dCas9複合体に対して多数のGFPタンパク質を相互作用させるCRISPR-IMSベクターを構築し、シロイヌナズナ植物体に導入した。
RVE標的プロモーターの1つについてgRNAを含むCRISPR-IMSベクターを導入した植物体を用いて蛍光観察を行った結果、根において核内で顆粒状のシグナルが検出された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

dCas9を用いたプロモーターのラベルを行うためのコンストラクトやgRNA評価系を構築し、標的プロモーターにおけるgRNAの選抜と植物体への導入を計画通り進めることができた。

Strategy for Future Research Activity

各プロモーターのgRNAと3×FLAG-dCas9を発現させた植物体を用いたenChIPを行い、質量分析装置を用いて共免疫沈降産物を同定する。通常生育条件だけでなく低温・高温ストレス条件下での植物体について同様の解析を行い、共精製産物やそれらの修飾状態を比較する。
イメージング解析については、他のプロモーターのgRNAを含むCRISPR-IMSベクターを導入した植物体の作出と蛍光観察を進めるとともに、別のアプタマーやタグシステムを用いた新規イメージング用ベクターを構築することで、地上部の細胞でも蛍光が見られるシステムの開発を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Structural changes in cell wall pectic polymers contribute to freezing tolerance induced by cold acclimation in plants (2024)
  • Author(s): Takahashi Daisuke、Soga Kouichi、Kikuchi Takuma、Kutsuno Tatsuya、Hao Pengfei、Sasaki Kazuma、Nishiyama Yui、Kidokoro Satoshi、Sampathkumar Arun、Bacic Antony、Johnson Kim L.、Kotake Toshihisa
  • Journal Title: Current Biology Volume: 34 Issue: 5 Pages: 958-968.e5
  • DOI: 10.1016/j.cub.2024.01.045
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Regulatory networks in plant responses to drought and cold stress (2024)
  • Author(s): Kim June-Sik、Kidokoro Satoshi、Yamaguchi-Shinozaki Kazuko、Shinozaki Kazuo
  • Journal Title: Plant Physiology Volume: 195 Issue: 1 Pages: 170-189
  • DOI: 10.1093/plphys/kiae105
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Clock-regulated coactivators selectively control gene expression in response to different temperature stress conditions in Arabidopsis (2023)
  • Author(s): Kidokoro Satoshi、Konoura Izumi、Soma Fumiyuki、Suzuki Takamasa、Miyakawa Takuya、Tanokura Masaru、Shinozaki Kazuo、Yamaguchi-Shinozaki Kazuko
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 120 Issue: 16
  • DOI: 10.1073/pnas.2216183120
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The ability to induce heat shock transcription factor-regulated genes in response to lethal heat stress is associated with thermotolerance in tomato cultivars (2023)
  • Author(s): Mizoi Junya、Todaka Daisuke、Imatomi Tomohiro、Kidokoro Satoshi、Sakurai Tetsuya、Kodaira Ken-Suke、Takayama Hidehito、Shinozaki Kazuo、Yamaguchi-Shinozaki Kazuko
  • Journal Title: Frontiers in Plant Science Volume: 14 Pages: 1269964-1269964
  • DOI: 10.3389/fpls.2023.1269964
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Constitutively active B2 Raf-like kinases are required for drought-responsive gene expression upstream of ABA-activated SnRK2 kinases (2023)
  • Author(s): Soma Fumiyuki、Takahashi Fuminori、Kidokoro Satoshi、Kameoka Haruka、Suzuki Takamasa、Uga Yusaku、Shinozaki Kazuo、Yamaguchi-Shinozaki Kazuko
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 120 Issue: 24
  • DOI: 10.1073/pnas.2221863120
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 植物の低温ストレス初期応答における転写制御機構の解明 (2024)
  • Author(s): 城所聡
  • Organizer: 第65回日本植物生理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Transcriptional regulations of cold-inducible gene expression by clock-related transcription factors in Arabidopsis (2023)
  • Author(s): Kidokoro S
  • Organizer: 13th CSHL meeting Plant Genomes, Systems Biology and Engineering
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 植物の低温ストレスへの初期応答における転写制御機構 (2023)
  • Author(s): 城所聡
  • Organizer: 第40回日本植物バイオテクノロジー学会大会
  • Invited
• [Presentation] Analysis of transcriptional regulations of temperature-stress inducible genes mediated by clock-related transcription factors in Arabidopsis. (2023)
  • Author(s): Kidokoro S, Konoura I, Hayashi K, Soma F, Suzuki T, Miyakawa T, Tanokura M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K.
  • Organizer: 33th International Conference on Arabidopsis Research
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] シロイヌナズナの概日時計関連コアクチベーターであるLNKファミリーが 低温ストレス誘導性遺伝子発現を制御する (2023)
  • Author(s): 城所聡、神浦泉、相馬史幸、鈴木孝征、宮川拓也、田之倉優、篠崎一雄、 篠崎和子
  • Organizer: 第68回低温生物工学会