Functional analysis of radical SAM enzymes that catalyze various radical-mediated reactions

Publicly Offered Research

Project Area	Systems biosynthetics based on accumulation, prediction, and creation of biological reactions
Project/Area Number	23H04549
Research Category	Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Transformative Research Areas, Section (II)
Research Institution	Institute of Science Tokyo
Principal Investigator	工藤史貴東京工業大学, 理学院, 准教授 (00361783)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥10,790,000 (Direct Cost: ¥8,300,000、Indirect Cost: ¥2,490,000) Fiscal Year 2024: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000) Fiscal Year 2023: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Keywords	ラジカルSAM酵素 / ラジカル反応 / 生合成 / 天然物 / ゲノムマイニング
Outline of Research at the Start	本研究は、微生物ゲノムにコードされている推定ラジカルSAM酵素の機能を解明することにより、新規な炭素ラジカル反応を集積することを目的としている。多種多様な生理活性天然物の生合成において、ラジカルSAM酵素による炭素ラジカルを活用した変換反応が鍵を握ることが多いからである。当研究室ではこれまでに、アミノグリコシド系抗生物質の生合成における複数のラジカルSAM酵素の機能解析に成功しており、独自の研究手法を蓄積してきた。これを基盤として機能未解明のラジカルSAM酵素の機能を解明することで、本領域が目指す生体反応の集積に貢献する。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は機能未知のラジカルS-アデノシル-L-メチオニン（SAM）酵素の機能解明を目的としている。 2023年度はまず、SAMの4''-位のC-メチル化を触媒すると推定したラジカルSAM酵素の発現・精製を検討した。当研究室で蓄積してきた発現手法やホモログ酵素の発現・精製を種々検討したが、現時点では酵素反応解析に使える酵素の調製に成功していない。そこで本酵素の機能を間接的に証明するために、有機合成と酵素合成を組み合わせて生成物標品を調製し、それを基質とすると推定された酵素の機能解析を行った。結果として、4''-位をC-メチル化したSAMを基質として生成物に変換する酵素活性を見出すことができた。メチル化してないSAMや4''-位の立体化学が反対のものは基質としてほとんど変換されなかったことから、この酵素は4''-位メチル化SAMを厳密に認識していることが明らかとなった。また、このことから研究対象としているラジカルSAM酵素は、SAMの4''-位を立体選択的にC-メチル化することが示唆された。また2023年度は、多くの細菌が有するバクテリオホパンポリオール（BHP）の生合成において、グリコシドの縮環反応を触媒するラジカルSAM酵素の触媒活性を見出すことに成功した。本研究では、BHPを生産するZymomonas mobilisの幾つかの生合成遺伝子を破壊することで生合成中間体を蓄積させて、ラジカルSAM縮環酵素の推定基質を調製した。ラジカルSAM縮環酵素については触媒活性を見出しただけなので、次年度に精密解析を進める予定である。また本研究により、幾つかのBHP生合成中間体の調製方法を確立したので、BHPの構造多様化に関わるラジカルSAM酵素の機能解析に展開できるようになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ラジカルSAM酵素の機能解析は難易度が高く、期待したような酵素活性を見出すことができないことも多いが、2023年度に計画していた幾つかのラジカルSAM酵素の機能解析のうち、BHP生合成に関わるグリコシドの縮環酵素の触媒活性を見出すことができたことは評価できる。次年度の精密解析に向けて視界が開けた。一方で、比較的容易に機能解析をできると期待していたラジカルSAM C-メチル化酵素については、発現・精製に苦戦しており、酵素調製方法に課題があることが分かってきた。また、ラジカルSAM酵素の基質調製のための酵素や反応生成物を基質とする酵素の機能を解明できたことも評価できる。今後の本研究領域における新たな研究課題の発掘につながっている。
Strategy for Future Research Activity	2024年度は、BHP生合成における縮環酵素の精密機能解析を進める。推定されるラジカル中間体のクエンチに関わると考えられるアミノ酸残基の特定などを進める。そのためにも純粋な基質を調製する。この機能解析については2024年度中に論文化したい。また幾つかのBHP生合成中間体の調製方法を確立したので、BHPの構造多様化に関わるラジカルSAM 酵素の機能解析を進める。まずは推定酵素の発現・精製検討から始める。 SAMの4''-位を立体選択的にC-メチル化するラジカルSAM酵素については、引き続き発現・精製条件を検討する。このような調製困難な酵素の発現・精製方法を確立することができれば、ラジカルSAM酵素の機能解析において有用な知見を引き出せると考えられる。