Rational molecular evolution of CO dehydrogenase (CODH) from HCP, an ancestral CODH-type enzyme without CODH activity

Publicly Offered Research

Project Area	CO world
Project/Area Number	23H04648
Research Category	Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Transformative Research Areas, Section (II)
Research Institution	Saitama University
Principal Investigator	藤城貴史埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (20740450)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥13,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000、Indirect Cost: ¥3,000,000) Fiscal Year 2024: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Keywords	COデヒドロゲナーゼ / Hybrid cluster protein / 金属酵素 / X線結晶構造解析 / 人工酵素 / CO dehydrogenase / Ni / 分子進化 / 還元 / 変異 / 一酸化炭素デヒドロゲナーゼ / CODH / HCP
Outline of Research at the Start	太古の嫌気的な地球環境で生まれた初期生物は、生命維持に必要なエネルギーや炭素源の獲得に、一酸化炭素（CO）に依存した代謝系、および、その代謝系に特有のNi含有CO代謝酵素「COデヒドロゲナーゼ（CODH）」を有する。これまでにCODHの触媒機構や、その酵素ファミリーの多様な分子種は解明が進んでいるが、CODHの起源については未だ定かではない。本研究ではCODHの祖先型酵素として最も可能性の高いとされる酵素hybrid cluster protein (HCP)を用いて、変異導入実験によるHCPのCODHへの分子進化過程を再現し、生物界におけるCODHの発生起源を分子レベルで理解することを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	当該年度では、CODHの祖先型であるHCPの３つのclassのうち、最も研究が進んでいるclass IのHCPへの変異導入によるCODH活性を持つHCP変異型作成を試みた。まずCODHとclass I HCP活性部位の金属クラスター周辺構造の比較の結果、CO/CO2を結合するのに重要となるNiイオンを活性部位に取り込むと予想されるチャネルがHCPにも存在することを確認した。 HCPの、推定Ni取り込み可能なチャネル周辺のアミノ酸残基のいくつかをCODH型アミノ酸に置換し、大腸菌組換え型酵素として発現、精製したところ、どの変異型も安定に大量精製することに成功した。EPR測定により、これらHCP変異型の活性部位の性状解析を行った結果、野生型HCPとは少し異なるシグナルを示したため、これらが野生型酵素とは異なる活性部位クラスター環境を持つことが示唆された。また、CODHに最も構造上近いと予想されたclass III HCPの構造解析にも成功し、その全体構造が二量体であること、クラスターの配置がCODHと相同であることを見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason CODHと同じ二量体型のHCPであるclass III HCPの構造解析に世界で初めて成功し論文として報告できた。よって、今後は単量体型HCPとして知られるclass I、class IIだけでなく、二量体型のclass III HCPも用いて、構造に基づくHCPからのCODHへの分子進化の再現実験が可能となった。
Strategy for Future Research Activity	今後は精製できたclass I HCP変異型をNi共存下、COまたはCO2雰囲気下でのCODH型の酵素反応を実施し、活性評価を行う。また、class IIやclass III HCPでも、同様に変異導入を行い、CODH活性を評価する。