ＤＮＡメチル化制御因子の構造形成を介したヒストン認識及びＤＮＡ脱メチル化保護機構

• Project Area: Target recognition and expression mechanism of intrinsically disordered protein
• Project/Area Number: 24113719
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 中村 照也 熊本大学, 生命科学研究部, 助教 (40433015)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2013)
• Budget Amount: ¥11,310,000 (Direct Cost: ¥8,700,000、Indirect Cost: ¥2,610,000); Fiscal Year 2013: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000); Fiscal Year 2012: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
• Keywords: エピジェネティクス / 天然変性タンパク質 / 構造生物学

Research Abstract

哺乳類の初期発生において，生殖細胞のゲノム全体は高度なメチル化を受けており，受精後から始まるゲノムの脱メチル化の制御は，正常な個体発生に必須であると考えられている．PGC7は，ヒストンH3 のメチル化を受けたリジンへの結合を介してDNAを脱メチル化から保護する雌性ゲノムの脱メチル化保護因子である．さらに，PGC7の結合因子 (PGC7BP) が見出され，PGC7が行うメチル化DNA保護の分子機構が明らかにされつつある．PGC7はアミノ酸配列からは天然変性タンパク質であることが示されていることから，その機能は，ターゲット分子との結合を介して一定の立体構造を形成することで誘起されると考えられる．本研究では，PGC7とメチル化リジンおよびPGC7BPとの複合体のＸ線結晶構造解析を行い，天然変性タンパク質であるPGC7がそれぞれのターゲット分子依存的な立体構造形成を介して，どのように機能発現するかを構造生物学的に明らかにする．
これまでの全長PGC7の精製実験から，多量体形成が起こりやすいことがわかったため，発現領域を変えたいくつかのPGC7の発現コンストラクトを作成した．これらの中でも安定なものについて精製を行い，現在結晶化スクリーニングを進めている．またPGC7とPGC7BPとの相互作用領域を明らかにするため，PGC7とPGC7BPとの結合領域の検討を行った．上述したPGC7の発現領域を変えたコンストラクトと，ドメイン構造を基に3つの領域に分割したPGC7BPにGSTを付加させたものを用いてGST-pull downアッセイを行い，PGC7およびPGC7BPの結合に必要なそれぞれの領域を明らかにした．現在，これらの情報を基に共発現による大量調製を行っている．

Current Status of Research Progress

Reason

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Mechanism of the nucleotidyl-transfer reaction in DNA polymerase revealed by time-resolved protein crystallography (2013)
  • Author(s): Nakamura T.
  • Journal Title: Biophysics Volume: 9 Pages: 31-36
  • NAID: 130003366027
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] DNAポリメラーゼηによるリン酸ジエステル結合の形成過程の観察 (2013)
  • Author(s): 中村照也
  • Journal Title: 生物物理 Volume: 53 Pages: 254-257
  • NAID: 10031191847
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 時分割タンパク質結晶学によるDNAポリメラーゼηのヌクレオチド転移反応の可視化 (2013)
  • Author(s): 中村照也
  • Journal Title: 日本結晶学会誌 Volume: 55 Pages: 42-46
  • NAID: 10031156005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of human MTH1 with a homogeneous N-terminus. (2013)
  • Author(s): Koga Y, Inazato M, Nakamura T, Hashikawa C, Chirifu M, Michi A, Yamashita T, Toma S, Kuniyasu A, Ikemizu S, Nakabeppu Y, Yamagata Y.
  • Journal Title: Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun Volume: 69(Pt 1) Issue: 1 Pages: 45-48
  • DOI: 10.1107/s1744309112048002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Watching DNA polymerase η make a phosphodiester bond. (2012)
  • Author(s): Nakamura T.
  • Journal Title: Nature Volume: 487 Issue: 7406 Pages: 196-201
  • DOI: 10.1038/nature11181
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Expression and purification for protein crystallography of a DNA methylation regulatory protein (2013)
  • Author(s): Nakamura T.
  • Organizer: The 2nd International Symposium on Intrinsically Disordered Proteins
  • Place of Presentation: 理化学研究所 横浜研究所
  • Year and Date: 2013-01-23
• [Presentation] DNA損傷修復に働く酸化ヌクレオチド分解酵素MutTとDNAポリメラーゼηの反応機構の解明 (2013)
  • Author(s): 中村照也
  • Organizer: 平成25年度日本結晶学会年会，進歩賞受賞講演
  • Place of Presentation: 熊本大学
  • Invited
• [Presentation] ヒトDNA polymerase ηによるヌクレオチド転移反応機構の解明 (2012)
  • Author(s): 中村照也
  • Organizer: 遺伝研研究集会 「遺伝情報の安定性を支える分子メカニズム」
  • Place of Presentation: 国立遺伝学研究所
  • Year and Date: 2012-10-03
  • Invited
• [Presentation] Watching DNA polymerase η make a phosphodiester bond (2012)
  • Author(s): Nakamura T.
  • Organizer: 第50回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学
  • Year and Date: 2012-09-22
  • Invited