天然変性構造を持つＥＧＦ受容体分子認識ドメインの１分子構造ダイナミクス解析

• Project Area: Target recognition and expression mechanism of intrinsically disordered protein
• Project/Area Number: 24113726
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 佐甲 靖志 独立行政法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 主任研究員 (20215700)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2013)
• Budget Amount: ¥12,350,000 (Direct Cost: ¥9,500,000、Indirect Cost: ¥2,850,000); Fiscal Year 2013: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2012: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
• Keywords: １分子計測 / 蛋白質 / 構造ダイナミクス / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 細胞増殖因子

Research Abstract

上皮成長因子受容体(EGFR)分子認識ドメインの構造ダイナミクスを１分子解析し、細胞内情報処理における役割の理解を目指す。EGFRはチロシンキナーゼ型細胞膜受容体であり、天然変性状態にある細胞質末端約220アミノ酸残基の分子認識ドメインで細胞質蛋白質と多状態相互作用する。
本研究では、分子認識ドメインの構造分布と構造状態遷移ダイナミクスを、２チャンネルタイムスタンプ法による単一分子内FRET検出を用いて計測する。具体的には、大腸菌でリコンビナント精製した分子認識ドメインのアミノ末端を蛍光色素Alexa488、末端から約70残基の位置にある内在性のシステインを蛍光色素Alexa555で２重標識してFRET計測を行った。また、作成分子の分子認識活性を調べるため、２カ所のチロシン残基をグルタミン酸置換したリン酸化模倣体を作成し、細胞質蛋白質Grb2との１分子結合反応計測を行った。
リン酸化模倣体と蛍光標識Grb2は3~4成分の結合時間分布を示し、速い３成分は以前に細胞膜から調整したリン酸化EGFRとGrb2の間で観測された３成分の結合時間と類似の時定数および成分比であったことから、リン酸化模倣体は野生型のリン酸化分子と同様の構造・機能を有すると考えた。リン酸化模倣体の構造分布をFRET計測したところ、非リン酸型と比べ、中間的なFRET効率を示す画分の成分比が上昇し、かつ、この画分のFRET効率分布幅が拡大していることが示唆された。リン酸化模倣体とGrb2を混合すると、この画分のFRET効率が減少することが分かった。この画分を含めGrb2存在下でのリン酸化模倣体にはFRET効率の異なる４つの構造があると推定されたが、構造間の遷移(> 10s)はGrb2の結合時間(< 1s)に比べて遅く、何らかの構造ヒステリシスが存在すると思われる。我々の以前の研究から、EGFRとGrb2の間の反応記憶が発見されているが、構造ヒステリシスの存在は反応記憶の構造的基盤となっている可能性がある。

Current Status of Research Progress

Reason

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Ligand-induced population shift leads to the activation of rhodopsin, a G-protein coupled receptor (2014)
  • Author(s): Maeda, R., Hiroshima, M., Yamashita, T., Wada, A., Nishimura, S., Sako, Y., Shichida, Y., and Imamoto, Y
  • Journal Title: Biophys. J Volume: 106 (4) Issue: 4 Pages: 915-924
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2014.01.020
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rolling circle amplification in prokaryotic translation system using small circular RNA. (2013)
  • Author(s): Abe, N., Hiroshima, M., Maruyama, H., Nakashima, Y., Nakano, Y., Matsuda, A., Sako, Y., Ito, Y., and Abe, H.
  • Journal Title: Angew. Chem. Int. Ed. Volume: 52 Issue: 27 Pages: 7004-7008
  • DOI: 10.1002/anie.201302044
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clearance of yeast eRF-3 prion [PSI+] by amyloid enlargement due to the imbalance between chaperone Ssa1 and cochaperone Sgt2 (2013)
  • Author(s): Arai, C., Kurahashi, H., Pack, C.-G.., Sako, Y., and Nakamura, Y.
  • Journal Title: Translation. Volume: 1 Issue: 2 Pages: e26574-e26574
  • DOI: 10.4161/trla.26574
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Non-Markovian Properties and Multiscale Hidden Markovian Network Buried in Single Molecule Time Series (2013)
  • Author(s): Tahmina Sultana, Hiroaki Takagi, Miki Morimatsu, Hiroshi Teramoto, Chun-Biu Li, Yasushi Sako, Tamiki Komatsuzaki
  • Journal Title: The Journal of Chemical Physics Volume: 139 Issue: 24 Pages: 245101-245101
  • DOI: 10.1063/1.4848719
  • NAID: 120005385318
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dynamically varying interactions between heregulin and ErbB proteins detected by single-molecule analysis in living cells. (2012)
  • Author(s): Hirhoshima, M.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 109 Pages: 13984-13989
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microenvironments and different nanoparticle dynamics in living cells revealed by a standard nanoparticle. (2012)
  • Author(s): Pack, C.-G.
  • Journal Title: J. Contr. Rel. Volume: 163 Pages: 315-321
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Variational Bayes analysis of a photon-based hidden Markov model for single-molecule FRET trajectories. (2012)
  • Author(s): Okamoto, K.
  • Journal Title: Biophys. J. Volume: 103 Pages: 1315-1324
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Single-molecule imaging analysis of dynamics and reactions of a cell signaling molecule, epidermal growth factor receptor. (2013)
  • Author(s): Sako, Y.
  • Organizer: 4-th France-Japan Joint Seminar “Imaging of spatiotemporal hierarchies in living cells #8211; an overview of dynamics from molecules to cells #8211;“
  • Place of Presentation: Harima
  • Year and Date: 2013-01-09
  • Invited
• [Presentation] Single-molecule FRET measurement of an intrinsically disordered C-tail domain of an epidermal growth factor receptor. (2012)
  • Author(s): Okamoto, K.
  • Organizer: 日本生物物理学会第50回年会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2012-09-23
• [Presentation] Single-molecule imaging in life sciences. (2012)
  • Author(s): Sako, Y.
  • Organizer: OIST workshop “Fluorescence Microscopy: from Basics to Advanced”
  • Place of Presentation: Onna
  • Year and Date: 2012-06-05
  • Invited
• [Presentation] Single-molecule imaging of ErbB-Ras-MAPK systems
  • Author(s): Sako, Y.
  • Organizer: 1st Korea Symposium on Current Trends in Biophysics
  • Place of Presentation: Jeju
  • Invited
• [Presentation] Single-molecule analysis of intracellular reaction networks
  • Author(s): Sako, Y.
  • Organizer: KHUPO 14th Annual International Proteomics Conference
  • Place of Presentation: Busan
  • Invited
• [Book] Single-molecule imaging measurements of protein-protein interactions in living cells (2013)
  • Author(s): Hibino, K., Hiroshima, M., Nakamura, Y., and Sako, Y.
  • Total Pages: 21
  • Publisher: InTech
• [Remarks]
  • URL: http://www.riken.go.jp/cell-info/