脂質結合タンパク質の準安定構造と細胞膜酵素の機能の関連

• Project Area: Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states.
• Project/Area Number: 24121701
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 小椋 賢治 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 特任准教授 (50270682)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2013)
• Budget Amount: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000); Fiscal Year 2013: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2012: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
• Keywords: 核磁気共鳴 / タンパク質 / NMR / 立体構造解析

Research Abstract

細胞膜に埋め込まれた酵素は，細胞外の生理活性物質や細胞内シグナル伝達タンパク質などさまざまな因子によって活性制御を受けている．本研究は，活性酸素発生を触媒する細胞膜酵素NADPHオキシダーゼを制御する細胞質タンパク質p47phoxの準安定構造の生物学的意義を解明することを目的とした．
p47phoxはPX-SH3-SH3-AIRからなるマルチドメインタンパク質であり，活性酸素発生系の休止状態では，PXドメインが分子内マスクされており，細胞膜に移行しないような自己阻害立体構造を形成すると考えられているが，その分子機構は未解明であった．
p47phoxPXドメインにランタニド結合タグを付加した試料を調製した．常磁性ランタニドが誘起するPXドメインの偽接触シフト（PCS）から，Δχテンソルを決定した．さらに，Ins(1,3,4)P3がPXドメインに結合したときのPCSを測定した．Ins(1,3,4)P3はPXドメインに対してKd = 0.5mMと比較的弱い相互作用を示すが，Ins(1,3,4)P3のPCSとΔχテンソルを用いてp47phoxPXドメイン－Ins(1,3,4)P3複合体立体構造モデルを構築することができた．
さらに，p47phox（全長）にランタニド結合タグを付加した試料を調製し，PCSを測定した．PXドメイン単独の際に決定したΔχテンソルを用いてp47phox（全長）の自己阻害立体構造のモデルを構築することができた．

Current Status of Research Progress

Reason

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Practical applications of hydrostatic pressure to refold proteins from inclusion bodies for NMR structural studies. (2013)
  • Author(s): Ogura K, Kobashigawa Y, Saio T, Kumeta H, Torikai S, and Inagaki F.
  • Journal Title: Protein Engineering, Design and Selection Volume: 26 Pages: 409-416
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Conformational change of Sos-derived proline-rich peptide upon binding Grb2 N-terminal SH3 domain probed by NMR (2013)
  • Author(s): Ogura K, Okamura H.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 3 Pages: 2913-2913
  • NAID: 120005348191
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Practical applications of hydrostatic pressure to refold proteins from inclusion bodies for NMR structural studies. (2013)
  • Author(s): Ogura K., Kobashigawa Y., Saio T., Kumeta H., Torikai S., Inagaki F.
  • Journal Title: Protein Eng Des Sel. Volume: 26（6） Issue: 6 Pages: 409-16
  • DOI: 10.1093/protein/gzt012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer (2012)
  • Author(s): Mariko Yokogawa, Yoshihiro Kobashigawa, Naoki Yoshida, Kenji Ogura, Kohsuke Harada and Fuyuhiko Inagaki
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 287 Issue: 42 Pages: 34936-34945
  • DOI: 10.1074/jbc.m112.398255
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Conformational dynamics of yeast calmodulin in the Ca(2+)-bound state probed using NMR relaxation dispersion (2012)
  • Author(s): Kenji Ogura, Hideyasu Okamura, Masato Katahira, Etsuko Katoh, and Fuyuhiko Inagaki
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 586 Issue: 16 Pages: 2548-2554
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2012.06.031
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Convenient method for resolving degeneracies due to symmetry of the magnetic susceptibility tensor and its application to pseudo contact shift-based protein-protein complex structure determination (2012)
  • Author(s): Yoshihiro Kobashigawa, Tomohide Saio, Masahiro Ushio, Mitsuhiro Sekiguchi, Masashi Yokochi, Kenji Ogura, and Fuyuhiko Inagaki
  • Journal Title: Journal of Biomolecular NMR Volume: 53 Issue: 1 Pages: 53-63
  • DOI: 10.1007/s10858-012-9623-8
  • NAID: 120005946609
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMR structure note: a defective isoform and its activity-improved variant of a type III antifreeze protein from Zoarces elongates Kner (2012)
  • Author(s): Hiroyuki Kumeta, Kenji Ogura, Yoshiyuki Nishimiya, Ai Miura, Fuyuhiko Inagaki, and Sakae Tsuda
  • Journal Title: Journal of Biomolecular NMR Volume: 55 Issue: 2 Pages: 225-230
  • DOI: 10.1007/s10858-012-9703-9
  • NAID: 120005228323
  • Peer Reviewed
• [Presentation] NMRによるp47phox PXドメインとホスファチジルイノシトールの相互作用の解析 (2013)
  • Author(s): 小椋賢治，小橋川敬博，吉田直樹，住本英樹，稲垣冬彦
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取市）
  • Year and Date: 2013-06-12
• [Presentation] タンパク質NMRの新展開ーダイナミクスと創薬ー (2013)
  • Author(s): 小椋賢治
  • Organizer: 高知大学大学院博士課程医学専攻DCセミナー
  • Place of Presentation: 高知大学（高知市）
  • Year and Date: 2013-03-13
  • Invited
• [Presentation] NMRによるp47phox PXドメインとホスファチジルイノシトールの相互作用の解析 (2013)
  • Author(s): 小椋賢治，小橋川敬博，斎尾智英，横川真梨子，久米田博之，天野伸治郎，吉田直樹，住本英樹，稲垣冬彦
  • Organizer: 第52回NMR討論会
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂（金沢市）
• [Presentation] NADPHオキシダーゼ細胞質因子p47phoxの柔軟な構造と機能 (2012)
  • Author(s): 小椋賢治，住本英樹，稲垣冬彦
  • Organizer: 第85回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡市）
  • Year and Date: 2012-12-14
• [Presentation] Pseudo Contact Shiftが生み出す構造情報とその取り扱い (2012)
  • Author(s): 小椋賢治
  • Organizer: 平成24年度日本分光学会NMR分光部会集中講義
  • Place of Presentation: 東京大学（東京都）
  • Year and Date: 2012-10-24
  • Invited