Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
(1) 細胞膜でのフォスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）濃度変化を蛍光により計測細胞内で発現できるPIP3センサーの土台として、イノシトール四リン酸（IP4）との特異的な結合に依存して構造がわずかながら変化することがX線結晶構造解析から明らかになっているGRP1-PHドメインを用いた。PHドメインの構造情報に基づきcpGFP (circularly permuted GFP)のPHドメインへの融合可能な位置及びPIP3もしくはIP4の結合により構造変化する領域を評価し、構造変化の大きなループ部位でPHドメインを分割し（Split PHドメイン）、融合する位置及びリンカー長を変え、cpGFPを挿入した。円順列変異を施した蛍光性タンパク質cpGFPとリセプターとしてSplit化したGRP1-PHドメインを融合させたバイオセンサーは、IP4濃度変化に対して応答することを細胞外で確認した。(2) 種類の異なるイノシトールポリリン酸濃度変化を単一細胞内で同時計測カルシウムセンサーとイノシトール三リン酸（IP3）センサー、カルシウムセンサーとIP4センサーを導入したHeLa細胞において、それぞれカルシウム濃度とIP3濃度、カルシウム濃度とIP4濃度のヒスタミン刺激による時間的・空間的濃度変化を単一細胞内で同時にリアルタイムで計測する手法を確立した。IP3キナーゼの阻害剤として知られている小分子を用いて、単一細胞内でアゴニスト刺激に応じたカルシウムイオンとIP3 、IP4の動態を解析したところ、細胞内においてカルシウムイオン濃度が周期的に変動する「オシレーション」の発現にはIP3産生だけでなくIP4産生もまた重要な役割を果たすことが明らかになった。本手法が単一細胞内イノシトールリン酸類濃度変化を制御する小分子のスクリーニングを行ううえでの有用性を実証した。
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results) Presentation (7 results) (of which Invited: 1 results)
Nature Methods
Volume: 10 Issue: 12 Pages: 1232-1238
10.1038/nmeth.2690
Bioconjugate Chemistry
Volume: 24（12） Issue: 12 Pages: 2008-2014
10.1021/bc400327q
Methods
Volume: 0 Issue: 2 Pages: 1-9
10.1016/j.ymeth.2013.10.014
J. Am. Chem. Soc.
Volume: 135,9 Issue: 9 Pages: 3465-3473
10.1021/ja3097652
Chem. Eur. J.
Volume: In Press
Org. Biomol. Chem.
Volume: 10 Issue: 44 Pages: 8767-8769
10.1039/c2ob26722e
