Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
本年度では、昨年度までに開発した高い反応性を有するヘリックスD2型ペプチドタグを組み込んだ膜タンパク質に対するラベル化実験ならびに電子顕微鏡での可視化について検討を行った。ラベル化による可視化を目指す標的タンパク質としては、カリウムイオンチャネル(Kv2.1)ならびにGABA受容体サブユニット(GABAa-gamma2)の二つを選択した。両タンパク質にタグを導入した変異体をHEK293細胞あるいはIn uteroエレクトロポレーション法によりマウス胎児の脳内に発現させた後、凍結割断法により発現タンパク質を含む膜レプリカを作製した。これに対して、ビオチンを有する亜鉛錯体型のプローブ部を反応させた後電子顕微鏡を用いて観察を行った。様々な検討を行ったところ膜レプリカ上のペプチドタグのシステイン残基が酸化により失活する可能性が明らかとなり、この酸化に失活を抑制するためのレプリカ作製ならびに保存条件の探索が必要であった。その結果、一重項酸素阻害剤であるアジ化ナトリウムがシステイン残基の酸化失活に有効であることを明らかとした。今後、さらなる検討を進めることでタグ導入タンパク質の効率よいラベル化を達成することを目指す。また、電子顕微鏡での可視化応用を目指したヒスタグに対するリアクティブタグ法の開発を新たに進めた。今年度は特にヒスタグに対して強い親和性を有するNi錯体プローブのデザインと機能評価を行った。その結果、従来のNi-NTA (nitoriloacetic acitd)型プローブに比べて１６倍以上の強い親和性(Kd = 24 nM)を有するNi-IDA (iminodiacetic acid)型のプローブを見いだすことに成功した。このNi-IDA型プローブを用いて細胞表層に発現させたヒスタグ導入ブラジキニン受容体の蛍光バイオイメージグに成功した。
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter
Volume: 24
http://bunseki.phar.kyushu-u.ac.jp/index.html
