常磁性プローブを利用した準安定な複合体の立体構造解析

• Project Area: Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states.
• Project/Area Number: 24121722
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tokyo Metropolitan University
• Principal Investigator: 三島 正規 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (70346310)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2013)
• Budget Amount: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000); Fiscal Year 2013: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2012: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
• Keywords: 常磁性 / NMR / 構造解析 / 複合体

Research Abstract

1. SPOCドメインによるリン酸化SMRTの分子認識
転写抑制補因子SHARP(SMRT/HDAC-associated repressor protein)は、そのSPOCドメインにおいて転写抑制補因子SMRT/NcoRと相互作用することで、HDACをリクルートし、転写を抑制する。現在までに本領域における取り組みで、SPOCドメイン/リン酸化SMRT複合体の立体構造を決定し、SPOCドメインの変異体を用いた結合実験をSPRを用いて行うことにより、その分子認識機構を明らかにしていた。我々はさらにluciferaseによるレポーターアッセイをCV-1細胞を用いて行った。その結果、SPRからリン酸基の分子認識に重要であることがわかっていたR3552とK3516の変異体では顕著に転写抑制能が落ちることが明らかとなった。このことから、実際に細胞内でも、構造解析やSPRによって明らかにされたものと同様の分子認識メカニズムでリン酸基が認識され、複合体が形成されていると考えることができる。また各変異体の細胞内局在はすべて核内であることも確認した。
2. PKC全長の構造解析
Protein kinase C a (PKCa)は極めて多くの生命現象、疾患に関与することが知られている。しかしながら、各ドメイン間の相互作用が弱く、それらが柔らかなリンカーで結ばれているため、全長での構造解析には至っていない。C1Aドメインについては当初まったく可溶画分で発現しなかったが、コンストラクションを工夫することで、大腸菌からの調製を可能にし、その立体構造を決定した。また、収量は非常に少なかったが、sortase Aを用いてキナーゼドメインとライゲーションし、全長のPKCの再構成に向けて進展が得られた。

Current Status of Research Progress

Reason

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

25年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Structural insights into the recruitment of SMRT by the corepressor SHARP under phosphorylative regulation. (2014)
  • Author(s): Mikami S, Kanaba T, Takizawa N, Kobayashi A, Maesaki R, Fujiwara T, Ito Y,Mishima M.
  • Journal Title: Structure. Volume: 22 Issue: 1 Pages: 35-46
  • DOI: 10.1016/j.str.2013.10.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microtubule-binding sites of the CH domain of EBl and its autoinhibition revealed by NMR. (2013)
  • Author(s): Kanaba T, Maesaki R, Mori T, I to Y, Hakoshima T, Mishima M.
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta. Volume: 1834 Issue: 2 Pages: 499-507
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2012.10.013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High-resolution heteronuclear multidimensional NMR of proteins living insect cells using a baculovirus protein expression system ≪ (2013)
  • Author(s): Jumpei Hamatsu, Daniel O'Donovan, Takashi Tanaka, Takahiro Shirai, Yuichiro Hourai, Tsutomu Mikawa, Teppei Ikeya, Masaki Mishima, Wayne Boucher, Brian O. Smith, Ernest D. Laue, Masahiro Shirakawa, Yutaka Ito 4
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 135 Issue: 5 Pages: 1688-1691
  • DOI: 10.1021/ja310928u
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Divergent DNA-binding specificities of a group of ETHYLENE RESPONSE FACTOR transcription factors involved in plant defense. (2013)
  • Author(s): Shoji T, Mishima M, Hashimoto T.
  • Journal Title: Plant Physiol. Volume: 162 Issue: 2 Pages: 977-990
  • DOI: 10.1104/pp.113.217455
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of the second RRM domain of Nrd1, a fission yeast MAPK target RNA binding protein, and implication for its RNA recognition and regulation. (2013)
  • Author(s): Kobayashi A, Kanaba T, Satoh R, Fujiwara T, Ito Y, Sugiura R, Mishima M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 437 Issue: 1 Pages: 12-17
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.06.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An in-cell NMR study of monitoring stress-induced increase of cytosolic Ca2+ concentration in HeLa cells (2013)
  • Author(s): Dambarudhar Shiba Sankar Hembrama, Takahiro Haremakia, Jumpei Hamatsua, Jin Inouea, Hajime Kamoshidaa, Teppei Ikeyaa, Masaki Mishimaa, Tsutomu Mikawab, Nobuhiro Hayashic, Masahiro Shirakawad, Yutaka Ito
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 438 Issue: 4 Pages: 653-659
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.07.127
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] High-resolution heteronuclear multidimensional NMR of proteins in living insect cells using a baculovirus protein expression system. (2013)
  • Author(s): Hamatsu J,
  • Journal Title: J Am Chem Soc. Volume: 135 Pages: 1688-91
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microtubule-binding sites of the CH domain of EB1 and its autoinhibition revealed by NMR (2013)
  • Author(s): Kanaba, T.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1834 Pages: 499-507
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMR assignments of SPOC domain of the human transcriptional corepressor SHARP in complex with a C-terminal SMRT peptide (2012)
  • Author(s): Mikami S
  • Journal Title: Biomolecular NMR Assignments Volume: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] “Insights into substrate recognition by the Escherichia coli Orf135 protein through its solution structure (2012)
  • Author(s): Kawasaki, K
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 420 Pages: 263-268
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] H, 13C and 15N NMR Assignments of the Escherichia coli Orf135 protein (2012)
  • Author(s): Kawasaki, K
  • Journal Title: Biomolecular NMR Assignments Volume: 6 Pages: 1-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] メチルTROSY法を用いた巨大生体高分子のNMR解析と構造生物学への応用 (2012)
  • Author(s): 三島正規
  • Journal Title: 分光研究 Volume: 5 Pages: 194-195
  • NAID: 10031079566
  • Peer Reviewed
• [Presentation] RNA結合蛋白質 Nrd1の NMR法による構造解析 (2013)
  • Author(s): 小林彩保, 佐藤亮介, 藤原俊伸, 伊藤隆, 杉浦麗子, 三島正規
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 鳥取
• [Presentation] NMRを用いた溶液中のマルチドメインタンパク質 PKCの構造解析の試み (2013)
  • Author(s): 金場哲平, 秋吉克昂, 前崎綾子, 宮崎健介, 伊藤隆, 三島正規
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 鳥取
• [Presentation] 分裂酵母由来の MAP キナーゼによりリン酸化される RNA 結合タンパク質 Nrd1 の構造解析 (2013)
  • Author(s): Kobayashi A., Satoh R., Fujiwara T., Sugiura R., Ito Y., Mishima M
  • Organizer: 第 51 回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 京都
• [Presentation] MAPキナーゼによりリン酸化されるRNA結合タンパク質Nrd1の構造解析 (2013)
  • Author(s): 小林彩保, 佐藤亮介, 藤原俊伸, 伊藤隆, 杉浦麗子, 三島正規
  • Organizer: 第52回 NMR討論会
  • Place of Presentation: 金沢
• [Presentation] マルチドメインタンパク質Protein kinase Cの構造解析の試み (2013)
  • Author(s): 金場哲平, 矢巻菜央, 秋吉克昂, 前崎綾子, 宮崎健介, 伊藤隆, 三島正規
  • Organizer: 第52回 NMR討論会
  • Place of Presentation: 金沢
• [Presentation] 転写抑制補因子SHARP/SMRT複合体の溶液構造とCK2によるSMRTのリン酸化 (2012)
  • Author(s): 三島 正規
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2012-12-11
  • Invited
• [Presentation] NMRによるマルチドメインタンパク質PKCの構造解析 (2012)
  • Author(s): 秋吉 克昂
  • Organizer: 第51回NMR討論会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2012-11-08
• [Presentation] 転写因子IRF4 の溶液構造の解析 (2012)
  • Author(s): 榊 航平
  • Organizer: 第12回日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2012-06-20
• [Book] 細胞工学 （転写抑制補助因子のcasein kinase 2によるリン酸化と転写制御） (2014)
  • Author(s): 小林彩保、金場哲平、三島正規
  • Publisher: 学研メディカル秀潤社