基質消費スクリーニングを用いたテルペン酵素の多様化と機能進化

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 25108704
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 梅野 太輔 千葉大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00400812)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000); Fiscal Year 2014: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2013: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
• Keywords: テルペノイド / 進化分子工学 / 代謝工学 / スクリーニング / 反応特異性 / カロテノイド / ランダム変異

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，ランダム変異によって多様化したテルペン酵素の変異体プールの中から，独自技術を用いたハイスループットスクリーニングによって活性を保持した変異体を濃縮・回収する実験を多世代にわたって実施することを目標としている。世代を経るにつれ，テルペン酵素の反応特異性が変化し，その変異体の機能・配列相関をみることによって，このクラスの酵素の進化能を試すとともに，その反応特異性にかかわる部位の網羅的な洗い出しを目指した。
最初のアイデアは，カロテノイド合成経路との基質競合によってテルペン酵素の機能保持をコロニー色によって可視化するというシステムであった。これは手法として確立することができ，それをもとに複数の酵素の活性進化工学が可能となった。この手法をもって反応ポケットに集中的に変異を導入し，活性を保持しつつも配列の異なる種々のテルペン酵素変異体を得ることができた。
一方，更なるスループットの向上を目指し，蛍光タンパク質と薬剤耐性遺伝子の癒合タンパク質を，更にテルペン酵素に融合する実験を行った。この手法を用いることで，基質消費ではなくフォールディング（タンパク質構造）の保持に対して超高速に淘汰を与えることができるようになった。この技術により，テルペン酵素の配列発散速度を飛躍的に高めることができると期待される。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Production of squalene by squalene synthases and their truncated mutants in Escherichia coli. (2015)
  • Author(s): Katabami, A, Li, L., Iwasaki, M., Furubayashi, M., Saito, K., Umeno, D
  • Journal Title: J. Bioscience Bioengin Volume: 119 Issue: 2 Pages: 165-171
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2014.07.013
  • NAID: 110009922576
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Liquid-based iterative recombineering method tolerant to counter-selection escapes. (2015)
  • Author(s): Tominaga M, Kawai-Noma S, Kawagishi I, Sowa Y, Saito K, Umeno D.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 5 Issue: 3 Pages: e0119818-e0119818
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0119818
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rapid and Liquid-Based Selection of Genetic Switches Using Nucleoside Kinase Fused with Aminoglycoside Phosphotransferase (2015)
  • Author(s): Masahiro Tominaga, Kohei Ike, Shigeko Kawai-Noma, Kyoichi Saito, and Daisuke Umeno
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Issue: 3 Pages: e0120243-e0120243
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0120243
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Directed evolution of squalene synthase for dehydrosqualene biosynthesis (2014)
  • Author(s): Furubayashi M, Li L, Katabami A, Saito K, Umeno D.
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 588 Issue: 18 Pages: 3375-3381
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2014.07.028
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Construction of carotenoid biosynthetic pathways using squalene synthase. (2014)
  • Author(s): M. Furubayashi, L. Li, A. Katabami, K. Saito, D. Umeno
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 588 Pages: 436-442
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A high-throughput colorimetric screening assay for terpene synthase activity based on substrate consumption (2014)
  • Author(s): Furubayashi M, Ikezumi M, Kajiwara J, Iwasaki M, Fujii A, Li L, Saito K, Umeno D
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 9 Issue: 3 Pages: e93317-e93317
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0093317
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 1. The nucleoside-based positive/negative selection platform for evolutionary engineering of gene expression controllers (2014)
  • Author(s): Kohei Ike, and Daisuke Umeno,
  • Journal Title: Methods Mol Biol Volume: 1111 Pages: 141-152
• [Journal Article] Evolutionary analysis of the functional plasticity of Staphylococcus aureus C30 carotenoid synthases. (2013)
  • Author(s): M. Furubayashi, K. Saito, D. Umeno
  • Journal Title: J. Bioscience Bioengin. Volume: 79 Pages: 7298-7304
  • NAID: 210000004775
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Removal of urea from water using urease-immobilized fibers. (2013)
  • Author(s): M. Sugiyama, K. Ikeda, D. Umeno, K. Saito, T. Kikuchi,k K. Ando
  • Journal Title: J. Chem. Engin., JPN Volume: 46 Pages: 509-513
  • NAID: 10031188024
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of dose on mole percentages of polymer brush and root grafted onto porous polyethylene sheet by radiation-induced graft polymerization (2013)
  • Author(s): R．Ishihara, S. Uchiyama, H. Ikezawa, S. Yamada, H. Hirota, D. Umeno, K. Saito
  • Journal Title: Ind. Eng. Che.m. Res. Volume: 52 Pages: 12582-12586
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 1. 代謝経路と制御ネットワークの組織的な進化工学技術 (2013)
  • Author(s): 梅野 太輔, 冨永 将大, 古林 真衣子, 池 紘平
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume: 91 Pages: 26-29
• [Presentation] テルペノイド酵素と生合成経路の進化工学 (2014)
  • Author(s): 梅野太輔
  • Organizer: I-BIO-K 合成生物工学シンポジウム
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2014-11-25
  • Invited
• [Presentation] テルペン・イソプレノイド酵素の進化デザイン (2014)
  • Author(s): 梅野太輔
  • Organizer: 第３回植物二次代謝フロンティア研究会
  • Place of Presentation: 小田原
  • Year and Date: 2014-11-23 – 2014-11-24
  • Invited
• [Presentation] 実験室内で新規カロテノイド経路を創り，育てる (2014)
  • Author(s): 梅野太輔
  • Organizer: 第28回カロテノイド談話会
  • Place of Presentation: 石川文教会館
  • Year and Date: 2014-09-04 – 2014-09-05
  • Invited
• [Presentation] SELECTION TOOLS FOR EVOLUTIONARY ENGINEERING OF GENETIC CIRCUITS AND GENOMIC DNA (2014)
  • Author(s): Daisuke Umeno
  • Organizer: SEED meeting
  • Place of Presentation: 米国 カリフォルニア
  • Year and Date: 2014-07-14 – 2014-07-17
  • Invited
• [Presentation] 代謝ネットワークの進化デザイン (2014)
  • Author(s): 梅野太輔
  • Organizer: 新化学技術推進協会講演会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2014-06-14
  • Invited
• [Presentation] 代謝ネットワークの進化デザイン (2014)
  • Author(s): 梅野太輔
  • Organizer: 農芸化学会シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京
  • Invited
• [Presentation] A highly specific synthetic metabolic pathways assembled from promiscuous enzymes (2013)
  • Author(s): Maiko Furubayashi and Daisuke Umeno
  • Organizer: SB6.0
  • Place of Presentation: ロンドン, イギリス
  • Invited
• [Presentation] 分子触媒の「多体問題」と戦う？ 合成生物学の世界 (2013)
  • Author(s): 梅野太輔
  • Organizer: 第44回触媒サマーセミナー
  • Place of Presentation: 箱根
  • Invited
• [Presentation] Construction of the highly specific pathways out of promiscuous activity of engineered enzyme (2013)
  • Author(s): Daisuke Umeno
  • Organizer: ECI Conference on Enzyme Engineering
  • Place of Presentation: 富山
  • Invited
• [Presentation] Evolutionary design of genetic switches and circuits (2013)
  • Author(s): Daisuke Umeno
  • Organizer: iBIO-B
  • Place of Presentation: 北京, 中国
  • Invited
• [Book] 進化分子工学～高速分子進化によるタンパク質・核酸の開発 (2013)
  • Author(s): 伏見譲（監修）
  • Total Pages: 466
  • Publisher: エヌ・ティー・エス
• [Patent(Industrial Property Rights)] テルペン合成酵素をコードする遺伝子のスクリーニング方法 (2013)
  • Inventor(s): 梅野太輔，岩嵜美希
  • Industrial Property Rights Holder: 梅野太輔，岩嵜美希
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2013-104412
  • Filing Date: 2013-05-16