イソキノリンアルカロイド生合成マシナリーの構築

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 25108713
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 佐藤 文彦 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (10127087)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2014: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2013: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 生合成酵素遺伝子 / 合成生物学 / 植物有用二次代謝産物 / イソキノリンアルカロイド / 微生物生産

Outline of Annual Research Achievements

植物のイソキノリンアルカロイド生合成系のうち、レチクリンからサンギナリン生合成系の微生物における再構築について検討した。
１）前年度、サンギナリン生合成系の8遺伝子、ならびに、tetrahydroberberine(THB)生合成系のSMT、CYP719A1の2遺伝子、計10遺伝子をPichia酵母ゲノムに多重遺伝子導入することの可能性を報告した。今年度、さらに追試した結果、得られた多重遺伝子形質転換体（BBE、CYP719A5が機能した株、BBE、SMT、CYP719A1が機能した株、BBE、SMT、CYP719A1、SNMTが機能した株）の遺伝子発現が不安定であることが判明した。
２）そこで、導入遺伝子の安定発現を目指して、複数遺伝子を単一コンストラクトにて同時導入する方法を検討した。具体的には、BBE、CYP719A5、CYP719A2/A3遺伝子を対象として、同時発現を可能とする発現コンストラクトを作成し、その導入によるレチクリンからstylopineの産生を検討した。その結果、複数遺伝子を同時導入した菌体において、遺伝子を個別導入した菌体を共培養した場合を上回るレチクリンからstylopineへの効率的変換を認めた。
３）一方、単一のコンストラクトに同時導入できる遺伝子数（遺伝子長）には限りがあることから、個別の遺伝子を導入した形質転換酵母、具体的には、MSHとP6Hを導入したPichia酵母とSNMTを導入したPichia酵母も作成し、その共培養により、THBからのdihydrochelerythrineの合成が可能であることを明らかした。
上記の結果から、２）3）で得た形質転換酵母の共培養により、レチクリンからdihydrosanguinarine合成経路の再構築が可能と推定した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] (R,S)-Tetrahydropapaveroline Production by Stepwise Fermentation Using Engineered Escherichia coli. (2014)
  • Author(s): A. Nakagawa, C. Matsuzaki, E. Matsumura, T. Koyanagi, T. Katayama, K. Yamamoto, F. Sato, H. Kumagai, and H. Minami
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 4:6695 Issue: 1 Pages: 1-8
  • DOI: 10.1038/srep06695
  • NAID: 120006358778
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Knockdown of the NHR-8 Nuclear Receptor Enhanced Sensitivity to the Lipid-Reducing Activity of Alkaloids in Caenorhabditis elegans. (2014)
  • Author(s): Y.-L. Chow, Y. Kawasaki, and F. Sato
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem Volume: 78 Issue: 12 Pages: 2008-2013
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.940278
  • NAID: 120005601058
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Asymmetric Synthesis of Tetrahydro-isoquinolines by Enzymatic Pictet-Spengler Reaction (2014)
  • Author(s): M. Nishihachijo, Y. Hirai, S. Kawano, A. Nishiyama, H. Minami, T. Katayama, Y. Yasohara, F. Sato, and H. Kumagai
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: 78
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Screening of Isoquinoline Alkaloids for Potent Lipid Metabolism Modulation with <i>Caenorhabditis elegans</i> (2013)
  • Author(s): Y.L. Chow, and F. Sato
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume: 77 Issue: 12 Pages: 2405-2412
  • DOI: 10.1271/bbb.130523
  • NAID: 130003381957
  • ISSN: 0916-8451, 1347-6947
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Improvement of Reticuline Productivity from Dopamine by Using Engineered <i>Escherichia coli</i> (2013)
  • Author(s): J.-S. Kim, A. Nakagawa, Y. Yamazaki, E. Matsumura, T. Koyanagi, H. Minami, T. Katayama, F. Sato, and H. Kumagai
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume: 77 Issue: 10 Pages: 2166-2168
  • DOI: 10.1271/bbb.130552
  • NAID: 130003381909
  • ISSN: 0916-8451, 1347-6947
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of Plant Functions Using Cultured Plant Cells, and Biotechnological Applications (2013)
  • Author(s): Sato, F.
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume: 77 Issue: 1 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1271/bbb.120759
  • NAID: 10031164684
  • ISSN: 0916-8451, 1347-6947
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microbial production of isoquinoline alkaloids as plant secondary metabolites based on metabolic engineering research (2013)
  • Author(s): Sato, F.and Kumagai, H.
  • Journal Title: Proceedings of the Japan Academy, Series B Volume: 89 Issue: 5 Pages: 165-182
  • DOI: 10.2183/pjab.89.165
  • NAID: 130003365115
  • ISSN: 0386-2208, 1349-2896
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ドラフトゲノムデータを用いたハナビシソウアルカロイド生合成 P450 遺伝子の探索 (2015)
  • Author(s): 堀 健太郎、山田 泰之、佐藤 文彦
  • Organizer: 日本農芸化学会２０１５年度大会
  • Place of Presentation: 岡山大学農学部（岡山）
  • Year and Date: 2015-03-28
• [Presentation] 微生物を用いたイソキノリンアルカロイドstylopine生産系の構築 (2015)
  • Author(s): 岡野峻祐、堀健太郎、佐藤文彦
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部第４８８回講演会
  • Place of Presentation: 楽友会館（京都）
  • Year and Date: 2015-01-31
• [Presentation] イソキノリンアルカロイド生合成マシナリー構築 (2014)
  • Author(s): 佐藤文彦
  • Organizer: 新学術領域研究 生合成マシナリー 第８回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学大学院薬学研究科総合研究棟薬学部講堂（東京）
  • Year and Date: 2014-12-06
  • Invited
• [Presentation] P450s and plant isoquinoline alkaloid biosynthesis (2014)
  • Author(s): Fumihiko Sato
  • Organizer: 12th International symposium on cytochrome P450: Biodiversity and biotechnology
  • Place of Presentation: Kyoto
  • Year and Date: 2014-09-24 – 2014-09-28
  • Invited
• [Presentation] 微生物を用いたイソキノリンアルカロイド生合成経路の再構築 (2014)
  • Author(s): 堀健太郎、岡野峻祐、佐藤文彦
  • Organizer: 第３２回日本植物細胞分子生物学会（盛岡）大会・シンポジウム
  • Place of Presentation: いわて県民情報交流センター（盛岡）
  • Year and Date: 2014-08-22
• [Presentation] 微生物を用いた sanguinarine 生合成経路の再構築
  • Author(s): 堀 健太郎、岡野 峻祐、佐藤 文彦
  • Organizer: 日本農芸化学会平成２６年度大会
  • Place of Presentation: 明治大学生野キャンパス
• [Book] Plant Secondary Metabolism, In: eLS 2014 (2014)
  • Author(s): Sato, Fumihiko
  • Total Pages: 13
  • Publisher: John Wiley & Sons Ltd
• [Book] Improved Production of Plant Isoquinoline Alkaloids by Metabolic Engineering,” In Advances in Botanical Research; Giglioli-Guivarc'h, N., Ed. (2013)
  • Author(s): F. Sato
  • Publisher: Academic Press: London
• [Book] Bioengineering of Isoquinoline Alkaloid Production in Microbial Systems,” In Advances in Botanical Research; Giglioli-Guivarc'h, N., Ed. (2013)
  • Author(s): A. Nakagawa, E. Matsumura, F. Sato, and H. Minami
  • Publisher: Academic Press: London
• [Remarks] 京都大学アカデミックデイ 植物の薬用成分を効率的に作る
  • URL: http://research.kyoto-u.ac.jp/academic-day/2014/07/