大腸菌バーコード欠失株による化合物-遺伝子相互作用Multiplex解析

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 25108716
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 森 浩禎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (90182203)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2014: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2013: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 分子バーコード欠失株 / population dynamics / deep sequencing / 接合移動 / 低コピー発現プラスミド / ケミカルジェノミクス / 大腸菌 / 分子バーコード / 一遺伝子欠失株 / deep sequence / 低コピー可動型発現プラスミド / population変動 / multiplex解析

Outline of Annual Research Achievements

barcodeライブラリの完成、欠失を相補する接合可動型低コピー発現プラスミドライブラリーの構築、そして欠失株相補ライブラリーのリソース群の完成を目指した。その後構築したライブラリーによる高効率生理活性物質探索システムの構築を行うことを目的とした開発を目指した。barcodeによる混合培養液を用いて、長期定常期での各欠失株のpopulation変動を定量的にモニターすることが可能かどうかの評価を行った結果、少なくともbarcodeの量的変動をdeep sequencingで定量的に解析可能であることを確認することができた。その原理を用いて、化学物質の細胞内相互作用分子探索、作用機序解明を目的に、multi well プレートでの欠失株混合培養による競合培養とでdeep sequencingを用いた相互作用解析法の構築を行った。パイロットテストとして、細胞に対して毒性を示す溶媒など24種類の化合物を含む培地で欠失株混合液を生育させ、一定時間培養後に各wellの培養液より染色体DNAを抽出し、barcode領域をPCR増幅後、deep seqeuncingにより各欠失株のpopulation 変動を解析した。頻度解析を行い、その結果をクラスター解析を行うことで、化合物と各遺伝子との相互作用解析を行った。さらに新たな接合可動型プラスミドクローン発現ライブラリーとbarcode 欠失株を組合せ、発現誘導剤添加によるターゲット遺伝子の発現誘導増産による相互作用解析法の確立も進めた。薬剤による増産によるpopulation変動への影響は次年度に持ち越したが、ライブラリー構築は完成した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] GenoBase: comprehensive resource database of Escherichia coli K-12 (2015)
  • Author(s): Otsuka Y, Muto A, Takeuchi R, Okada C, Ishikawa M, Nakamura K, Yamamoto N, Dose H, Nakahigashi K, Tanishima S, Suharnan S, Nomura W, Nakayashiki T, Aref WG, Bochner BR, Conway T, Gribskov M, Kihara D, Rudd KE, Tohsato Y, Wanner BL & Mori H
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 43 Issue: D1 Pages: 606-617
  • DOI: 10.1093/nar/gku1164
  • NAID: 120005830851
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Colony-live -a high-throughput method for measuring microbial colony growth kinetics- reveals diverse growth effects of gene knockouts in Escherichia coli (2014)
  • Author(s): Takeuchi, R. Tamura, T. Nakayashiki, T. Tanaka, Y. Muto, A. Wanner, B. L. Mori, H.
  • Journal Title: BMC Microbiol Volume: 14 Issue: 1 Pages: 171-182
  • DOI: 10.1186/1471-2180-14-171
  • NAID: 120005830845
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Development of a system for discovery of genetic interactions for essential genes in Escherichia coli K-12 (2013)
  • Author(s): Yong Han Tek et al.
  • Journal Title: Genes Genet Syst Volume: 88 Pages: 233-240
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of key regulators in glycogen utilization in E. coli based on the simulations from a hybrid functional Petri net model (2013)
  • Author(s): Tian Zhongyan et al.
  • Journal Title: BMC Syst Biol Volume: 7 Issue: S6
  • DOI: 10.1186/1752-0509-7-s6-s1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The tRNA Thiolation Pathway Modulates the Intracellular Redox State in Escherichia coli. (2013)
  • Author(s): NakayashikiT., Saito N., Takeuchi R., Kadokura H., Nakahigashi K., Wanner B. L., & Mori H.
  • Journal Title: J Bacteriol Volume: 195 Issue: 9 Pages: 2039-2049
  • DOI: 10.1128/jb.02180-12
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome-wide screening with hydroxyurea reveals a link between nonessential ribosomal proteins and reactive oxygen species production (2013)
  • Author(s): NakayashikiT. & Mori H
  • Journal Title: J Bacteriol Volume: 195 Issue: 6 Pages: 1226-1235
  • DOI: 10.1128/jb.02145-12
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Systematic analysis of genetic interaction between sRNA and protein coding genes in E. coli. (2013)
  • Author(s): Wataru Nomura and Hirotada Mori
  • Organizer: American Society of Microbiology. 113th General Meeting
  • Place of Presentation: Denver, Colorado, USA
• [Book] Identification of Essential Genes and Synthetic Lethal Gene Combinations in Escherichia coli K-12 (2014)
  • Author(s): Hirotada Mori Katsushi Yokoyama Rikiya Takeuchi Kazuichi Makishi Wataru Nomura Yuta Otsuka Hitomi Dose Barry L. Wanner
  • Total Pages: 21
  • Publisher: Springer
• [Book] Microbial Production. From Genome Design to Cell Engineering. Hideharu Anazawa and Sakayu Shimizu Editors. (2014)
  • Author(s): Hirotada Mori, et al.
  • Total Pages: 306
  • Publisher: Springer
• [Remarks] GenoBase
  • URL: http://ecoli.naist.jp/GB
• [Remarks] GenoBase
  • URL: http://ecoli.naist.jp/Lab