環状アミン・ポリケタイド融合化合物の生合成研究と微生物生産

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 25108721
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 鮒 信学 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (70361574)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000); Fiscal Year 2014: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2013: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
• Keywords: アルカロイド / 生合成

Outline of Annual Research Achievements

アルカロイドは有史以前から鎮痛剤、治療薬、嗜好品、染料として用いられているが、その生合成には不明な点が多い。tropane alkaloidの生合成はN-methyl-Δ1-pyrroliniumと3-oxoglutaric acidの分子間不斉Mannich反応を鍵反応とするが、本反応を触媒する酵素は同定されていない。
N-methyl-Δ1-pyrroliniumはリジン由来のアルカロイドの生合成中間体であり、その微生物生産系はアルカロイドの安価大量生産を可能にする。我々はN-methyl-Δ1-pyrroliniumを生産する組換え大腸菌を作製した。タバコNicotiana tabacum由来のPMTとMPOのcDNAを大腸菌で発現させ、各生成物のダンシル化体をHPLC、LC-MSにより分析した。その結果、PMTを発現させた大腸菌はmethylputrescineを生産した。PMTとMPOを共発現させた大腸菌ではmethylputrescineの生産量が減少しており、また、PMTとMPOのin vitro反応では微量の4-methylaminobutanalが検出された。N-methyl-Δ1-pyrroliniumは不安定な化合物のため、大腸菌内で安定に存在できないと考えられる。
次に、N-methyl-Δ1-pyrroliniumを合成した。NMRおよびMS解析により同定し、固相抽出法および陽イオン交換カラムを用いたHPLC分析系を構築した。
最後に、植物由来のcDNA の微生物における発現ライブラリーを作製した。4種類の植物の葉からのライブラリーの構築に成功した。今後、N-methyl-Δ1-pyrrolinium、3-oxoglutaric acidと反応させることで不斉Mannich反応を触媒する酵素をスクリーニングする

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] In vitro reconstitution of the catabolic reactions catalyzed by PcaHG, PcaB, and PcaL: The protocatechuate branch of the β-ketoadipate pathway in Rhodococcus jostii RHA1 (2015)
  • Author(s): Yamanashi T, Kim S.-Y., Hara H., and Funa, N.
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume: 79 Issue: 5 Pages: 830-835
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.993915
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Detection of oxygen addition peaks for terpendole E and related indole-diterpene alkaloids in a positive-mode ESI-MS (2014)
  • Author(s): Hongo, Y., Nakamura, T., Takahashi, S., Motoyama, T., Hayashi, T., Hirota, H., Osada, H., and Koshino, H.
  • Journal Title: Journal of Mass Spectrometry Volume: 49 Issue: 12 Pages: 537-542
  • DOI: 10.1038/ja.2014.80
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural basis for cyclization specificity of two Azotobacter type III polyketide synthases: a single amino acid substitution reverses their cyclization specificity (2013)
  • Author(s): Satou, R., Miyanaga, A., Ozawa, H., Funa, N., Katuyama, Y., Tanokura, M., Ohnishi, Y., and Horinouchi
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 288 Pages: 34146-34157
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 粘性細菌Sorangium cellulosum 由来 新規メラニン生合成酵素 (2015)
  • Author(s): 曽根祐輔、中村修人、金承榮、鮒信学
  • Organizer: 2015年度日本農芸化学会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-03-28
• [Presentation] Microbial production of curcuminoids. (2015)
  • Author(s): Nobutaka Funa
  • Organizer: 5th International Conference on Biomolecular Engineering
  • Place of Presentation: Texas, USA
  • Year and Date: 2015-01-15
  • Invited
• [Presentation] 環状アミン・ポリケタイド融合化合物の生合成研究と微生物生産 (2014)
  • Author(s): 鮒 信学
  • Organizer: 生物活性物質構造多様性創出システムの解明と制御、第8回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2014-12-05
• [Presentation] 大腸菌における生体内malonyl-CoA量に寄与する因子のスクリーニング (2014)
  • Author(s): 山本聡、山梨智也、鮒 信学
  • Organizer: 日本農芸化学会中部支部第 171 回例会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2014-10-11
• [Presentation] 環状アミン・ポリケタイド融合化合物の生合成研究と微生物生産 (2014)
  • Author(s): 鮒 信学
  • Organizer: 生物活性物質構造多様性創出システムの解明と制御、第7回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2014-06-21
• [Presentation] III型ポリケタイド合成酵素DpyAによるラクトン化の分子機構の解明 (2014)
  • Author(s): 谷美生夏、相澤光輝、金 承榮、高橋俊二、長田裕之、鮒 信学
  • Organizer: 2014年度日本放線菌学会大会
  • Place of Presentation: 筑波
  • Year and Date: 2014-06-20
• [Presentation] 脂肪酸合成経路の遮断による一次代謝産物の生産能の強化 (2014)
  • Author(s): 大石奈穂美、山梨智也、曽根祐輔、田辺友紀、山本聡、金承榮、鮒信学
  • Organizer: 日本農芸化学会2014年度大会
  • Place of Presentation: 東京
• [Presentation] Acetyl-CoA carboxylaseの発現によるクルクミンの微生物生産 (2014)
  • Author(s): 曽根祐輔、山梨智也、大石奈穂美、天野結香子、金承榮、鮒信学
  • Organizer: 日本農芸化学会2014年度大会
  • Place of Presentation: 東京
• [Presentation] Streptomyces reveromyceticus由来の新規III型ポリケタイド合成酵素の機能解析 (2013)
  • Author(s): 相澤光輝、小野寺渓斗、高橋俊二、小下雅比古、金 承榮、長田裕之、鮒 信学
  • Organizer: 2013年度日本放線菌学会大会
  • Place of Presentation: 広島
• [Presentation] 環状アミン・ポリケタイド融合化合物の生合成研究と微生物生産 (2013)
  • Author(s): 鮒 信学
  • Organizer: 生合成マシーナリー: 生物活性物質構造多様性創出システムの解明と制御、第5回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 北海道
• [Presentation] 環状アミン・ポリケタイド融合化合物の生合成研究と微生物生産 (2013)
  • Author(s): 鮒 信学
  • Organizer: 生合成マシーナリー: 生物活性物質構造多様性創出システムの解明と制御、第6回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 千葉