生合成マシナリー構築に向けたロドコッカス属細菌の宿主最適化と遺伝子ツールの拡充

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 25108728
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 北川 航 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (60415669)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2014: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2013: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: Rhodococcus / genome / antibiotics / cre/loxP / 生合成マシナリー / バイオテクノロジー / 抗生物質 / 遺伝子 / 微生物

Outline of Annual Research Achievements

ロドコッカス属細菌の最適化宿主株の構築のため、前年度までに取得した外来遺伝子を安定的に保持できる候補株について、それ以外の株と共にゲノム比較を行った。各株共通して保持しているものをロドコッカスの基本構成遺伝子構造とし、それ以外の部分は株に個性を与える要因となる遺伝子であると考えられる。しかし最適化宿主の候補株が、ある遺伝子を有していることが有利なのか、あるいは有していないことが有利であるかについては各遺伝子の詳細を調べる必要がある。このため、ロドコッカスの基本構造のみに単純化した(大規模にDNA領域を削除した)ゲノムの宿主株を作製、また個別の特に興味深い遺伝子については遺伝子破壊株、遺伝子導入株の作製を進めた。ゲノムの大規模領域削除株についてはcre/loxPのシステムをロドコッカスで初めて実行し、2つのプラスミドにloxLE配列とカウンターセレクション遺伝子、またはloxRE配列とcre recombinase遺伝子を分けて搭載し、それぞれのプラスミドには更に削除する領域の末端と相同な配列を片方ずつ導入した。この2つのプラスミドの二重シングルクロスオーバー変異株を作製し、その後にcre recombinaseを発現することで、2ステップの非常に簡便な方法によるゲノム削除の手法を開発することに成功した。またロドコッカスには多数の線状、環状プラスミドが存在するが、これらも不必要なものであるため、脱落手法についてsacB遺伝子を用いた新たな手法を構築した。プラスミドを3種保持する株については3回脱落の作業が必要となるが、こちらも高効率で達成する手法を開発する事に成功した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Draft genome sequence of Rhodococcus erythropolis JCM 6824, an aurachin RE antibiotic producer. (2014)
  • Author(s): Kitagawa, W., Hata, M., Sekizuka, T., Kuroda, M., and Ishikawa, J.
  • Journal Title: Genome Announcement Volume: 2 Issue: 5
  • DOI: 10.1128/genomea.01026-14
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Total synthesis of aurachins C, D, and L, and a structurally simplified analog of aurachin C (2014)
  • Author(s): Enomoto, Masaru Kitagawa, Wataru Yasutake, Yoshiaki Shimizu, Hiroki
  • Journal Title: Bioscience Biotechnology and Biochemistry Volume: 78 Issue: 8 Pages: 1324-1327
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.918494
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structure of the quinoline N-hydroxylating cytochrome P450 RauA, an essential enzyme that confers antibiotic activity on aurachin alkaloids (2014)
  • Author(s): Yasutake Y, Kitagawa W, Hata M, Nishioka T, Ozaki T, Nishiyama M, Kuzuyama T, Tamura T
  • Journal Title: FEBS Lett Volume: 588 Issue: 1 Pages: 105-110
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.11.016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cloning and heterologous expression of the aurachin RE biosynthesis gene cluster afford a novel cytochrome P450 for quinoline N-hydroxylation (2013)
  • Author(s): 北川航、尾崎太郎、西岡大樹、安武義晃、波多美弥子、西山 真、葛山智久、田村具博
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: Vol. 14(印刷中) Issue: 9 Pages: 1085-1093
  • DOI: 10.1002/cbic.201300167
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Insight into the relationship between antibiotic production and phylogenetic-classification of Rhodococcus erythropolis strains (2014)
  • Author(s): Wataru Kitagawa
  • Organizer: 17th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (ISBA17)
  • Place of Presentation: トルコ
  • Year and Date: 2014-10-09
• [Presentation] ロドコッカス属放線菌による難分解性化合物分解と抗生物質生合成に関する研究 (2014)
  • Author(s): 北川航
  • Organizer: 2014年度(第29回)日本放線菌学会大会
  • Place of Presentation: つくば市
  • Year and Date: 2014-06-19
  • Invited
• [Presentation] 抗菌活性物質aurachin類およびそのアナログ化合物の合成研究 (2014)
  • Author(s): 榎本賢、北川航、安武義晃、清水弘樹
  • Organizer: 日本農芸化学会2014年度大会
  • Place of Presentation: 川崎
• [Presentation] 抗菌活性物質aurachin類およびそのアナログ化合物の合成研究 (2013)
  • Author(s): 榎本賢、北川航、安武義晃、清水弘樹
  • Organizer: 日本農芸化学会北海道支部講演会
  • Place of Presentation: 札幌
• [Presentation] A novel cytochrome P450 RauA from Rhodococcus erythropolis responsible for conferring antibiotic activity on aurachin alkaloid (2013)
  • Author(s): Yasutake Y, Nishioka T, Kitagawa W, Tamura T
  • Organizer: BPPT-AIST Joint symposium on Life Science and Technology Innovation
  • Place of Presentation: インドネシア・ボゴール
• [Presentation] ロドコッカス属由来抗生物質aurachin REの生合成遺伝子解析 (2013)
  • Author(s): 北川 航、尾崎太郎、安武 義晃、西山真 、葛山智久、田村 具博
  • Organizer: 2013年度 日本放線菌学会大会
  • Place of Presentation: 広島
• [Presentation] PRODUCTION OF ANTIBIOTICS IN RHODOCOCCUS (2013)
  • Author(s): Kitagawa W, Tamura T
  • Organizer: The 12th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms (GIM 2013)
  • Place of Presentation: カンクン、メキシコ
• [Presentation] Development of Host Vector System and Antibiotic Production in Rhodococcus Species (2013)
  • Author(s): Kitagawa W, Tamura T
  • Organizer: American Society for Microbiology 113th General Meeting
  • Place of Presentation: デンバー、USA