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銅輸送タンパク質キャディーを用いたチロシナーゼ反応機構の解明

Publicly Offered Research

Project AreaStimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules
Project/Area Number 25109530
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Science and Engineering
Research InstitutionHiroshima University

Principal Investigator

的場 康幸  広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 准教授 (90363051)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2015-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2014)
Budget Amount *help
¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000)
Fiscal Year 2014: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2013: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Keywordsチロシナーゼ / 銅 / 結晶構造解析 / ラマンスペクトル
Outline of Annual Research Achievements

チロシナーゼは、活性中心に2つの銅イオン(二核銅)を有する酸化酵素であり、チロシンを水酸化しドーパへと変換する反応と、ドーパを脱水素してドーパキノンへと変換する反応を触媒する。申請者は、チロシナーゼに特異的な銅輸送タンパク質(キャディーと命名)との複合体として、チロシナーゼの三次元構造を決定した。本構造中において、キャディーのTyr98残基が、チロシナーゼの基質結合部位に位置している。最近、キャディーのTyr98残基がチロシナーゼの触媒作用により、ドーパキノンへと変換されうることを発見した。本研究ではチロシナーゼ・キャディー複合体を利用し、二核銅含有酵素チロシナーゼの反応機構の解明を目指す。
ラマンスペクトルを測定した結果、チロシナーゼをオキシ型に変換すると、初期段階でμ-η2:η2-ペルオキソ二核銅(II)が形成し、最終的にドーパセミキノン・Cu(II)複合体が生じることが明らかになった。さらに、X線結晶構造解析を用いた検討からは、チロシナーゼ・キャディー複合体の結晶中でオキシ型チロシナーゼを形成させると、Tyr98残基のオルト位に濃い電子密度が観測され、結晶中でもチロシナーゼ反応が進行していることが強く示唆された。また、オルト位に濃い電子密度が生じるのに先立って、2つの銅イオンのうちCuAと名付けた銅イオンが、Tyr98残基の水酸基の方に移動することが判明した。
これまでの検討から、キャディーのTyr98残基に対するチロシナーゼの大まかな反応機構を提唱することができた。次の課題として、Tyr98残基に対するチロシナーゼの反応性を弱めることで、短寿命の反応中間体を捉えることを試みた。具体的には、キャディーのTyr98残基をフッ化チロシンに置換することに取り組んだ。現時点で、無細胞タンパク質合成システムを用いて、チロシナーゼ・キャディー複合体を取得することに成功した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2014 Annual Research Report
  • 2013 Annual Research Report
  • Research Products

    (18 results)

All 2014 2013

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 1 results) Presentation (12 results) (of which Invited: 4 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] An alternative allosteric regulation mechanism of an acidophilic L-lactate dehydrogenase from Enterococcus mundtii 15-1A2014

    • Author(s)
      Y. Matoba, M. Miyasako, K. Matsuo, Kosuke Oda, M. Noda, F. Higashikawa, T. Kumagai, M. Sugiyama
    • Journal Title

      FEBS Open Bio.

      Volume: 4 Issue: 1 Pages: 834-847

    • DOI

      10.1016/j.fob.2014.08.006

    • Related Report
      2014 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] D-サイクロセリン生合成機構の解明と非天然型アミノ酸合成への応用2014

    • Author(s)
      的場 康幸
    • Journal Title

      Institute for Fermentation, Osaka, Research Communications

      Volume: 28 Pages: 134-134

    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Journal Article] Crystallographic and mutational analyses of tannase from Lactobacillus plantarum.2013

    • Author(s)
      Matoba Y, Tanaka N, Noda M, Higashikawa F, Kumagai T, Sugiyama M.
    • Journal Title

      Proteins

      Volume: 81 Issue: 11 Pages: 2052-2058

    • DOI

      10.1002/prot.24355

    • Related Report
      2013 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystallographic study to determine the substrate specificity on an L-serine-acetylating enzyme found in the D-cycloserine biosynthetic pathway2013

    • Author(s)
      Oda, K., Matoba, Y., Kumagai, T., Noda, M., and Sugiyama, M
    • Journal Title

      J. Bacteriol

      Volume: 195 Issue: 8 Pages: 1741-1749

    • DOI

      10.1128/jb.02085-12

    • Related Report
      2013 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Establishment of an in vitroD-cycloserine-synthesizing system by using O-ureido-L-serine synthase and D-cycloserine synthetase found in the biosynthetic pathway2013

    • Author(s)
      Uda, N., Matoba, Y., Kumagai, T., Oda, K., Noda, M., and Sugiyama, M
    • Journal Title

      Antimicrob. Agents Chemother

      Volume: 57 Issue: 6 Pages: 2603-2612

    • DOI

      10.1128/aac.02291-12

    • Related Report
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    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Production of the unnatural and optically active amino acids using the enzymes found in the D-cycloserine biosynthetic pathway2014

    • Author(s)
      的場 康幸
    • Organizer
      ノボザイムズバイオフォーラム2014
    • Place of Presentation
      千葉市 クロスウェーブ幕張
    • Year and Date
      2014-10-24
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    • Invited
  • [Presentation] 放線菌チロシナーゼの成熟化と反応機構2014

    • Author(s)
      的場 康幸
    • Organizer
      第27回生物無機化学夏季セミナー
    • Place of Presentation
      兵庫県姫路市 書写山円教寺
    • Year and Date
      2014-08-29 – 2014-08-31
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    • Invited
  • [Presentation] 二核銅酵素チロシナーゼの構造生物化学的研究2014

    • Author(s)
      的場 康幸
    • Organizer
      大阪大学理学部舩橋研究室セミナー
    • Place of Presentation
      大阪大学理学部
    • Year and Date
      2014-07-30
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      2014 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 二核銅酵素チロシナーゼの構造化学的研究と無機触媒開発への期待2014

    • Author(s)
      的場 康幸
    • Organizer
      第5回次世代材料・テクノロジー研究会
    • Place of Presentation
      名古屋工業大学2号館
    • Year and Date
      2014-07-09
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    • Invited
  • [Presentation] XFEL連続フェムト秒結晶構造解析:構造生物学の新時代2014

    • Author(s)
      溝端 栄一、福田 庸太、鈴木 守、南後 恵理子、菅原 道泰、矢橋 牧名、登野 健介、城地 保昌、島村 達郎、潘 東青、シャバス レオナルド、西澤 知宏、松村 浩由、林 高史、的場 康幸、杉山 成、村田 道雄、高木 淳一、井上 豪、岩田 想
    • Organizer
      第14回日本タンパク質科学会年会
    • Place of Presentation
      ワークピア横浜/横浜産貿ホール マリネリア
    • Year and Date
      2014-06-25 – 2014-06-27
    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] D-サイクロセリン生合成機構の解明と非天然型アミノ酸合成への応用2014

    • Author(s)
      的場 康幸
    • Organizer
      公益財団法人発酵研究所 第8回助成研究報告会
    • Place of Presentation
      大阪府豊中市 千里ライフサイエンスセンター
    • Year and Date
      2014-06-05
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      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] Lactobacillus plantarumタンナーゼのX線結晶構造2013

    • Author(s)
      田中 尚美, 的場 康幸, 野田 正文, 熊谷 孝則, 杉山 政則
    • Organizer
      日本乳酸菌学会2013年度大会
    • Place of Presentation
      北海道大学学術交流会館
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] X線結晶構造に基づいたD-サイクロセリン合成酵素DcsGの触媒機構の解明2013

    • Author(s)
      宇田 成利, 的場 康幸, 小田 康祐, 熊谷 孝則, 野田 正文, 杉山 政則
    • Organizer
      2013年度(第28回)日本放線菌学会大会
    • Place of Presentation
      メルパルク広島
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      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] ロイシルブラストサイジンSを脱アミノアシル化する酵素の同定2013

    • Author(s)
      桑田 祥, 的場 康幸, 小田 康祐, 野田 正文, 熊谷 孝則, 杉山 政則
    • Organizer
      2013年度(第65回)日本生物工学会大会
    • Place of Presentation
      広島国際会議場
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      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] O-ウレイド-L-セリン合成酵素DcsDの活性発現に重要なアミノ酸残基の特定2013

    • Author(s)
      宇田 成利, 的場 康幸, 小田 康祐, 熊谷 孝則, 野田 正文, 杉山 政則
    • Organizer
      2013年度(第65回)日本生物工学会大会
    • Place of Presentation
      広島国際会議場
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] 自然免疫の抑制に関わるセンダイウイルスCタンパク質と宿主転写因子STAT1の構造生物学的解析2013

    • Author(s)
      小田 康祐, 的場 康幸, 川端 凉子, 入江 崇, 福士 雅也, 坂口 剛正
    • Organizer
      第61回日本ウィルス学会学術集会
    • Place of Presentation
      神戸国際会議場
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] センダイウイルスCタンパク質と宿主転写因子STAT1の複合体構造2013

    • Author(s)
      小田 康祐, 的場 康幸, 江田 優子, 川端 涼子, 入江 崇, 福士 雅也, 坂口 剛正
    • Organizer
      第36回(2013年)日本分子生物学会
    • Place of Presentation
      神戸ポートピアホテル
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Book] Microbial Production: From Genome Design to Cell Engineering2014

    • Author(s)
      Matoba Y, Sugiyama M
    • Total Pages
      8
    • Publisher
      Springer Japan
    • Related Report
      2013 Annual Research Report

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Published: 2013-05-15   Modified: 2019-07-29  

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