蛍光シグナルを用いた膜タンパク質シェディングのイメージング

• Project Area: Mutli-dimensional fluorescence live imaging of cellular function and molecular activity
• Project/Area Number: 25113718
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 白壁 恭子 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (00345315)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥10,530,000 (Direct Cost: ¥8,100,000、Indirect Cost: ¥2,430,000); Fiscal Year 2014: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2013: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: シェディング / M-CSF受容体 / LPS / マクロファージ / 膜タンパク質 / イメージング

Outline of Annual Research Achievements

シェディングは膜貫通型のタンパク質を細胞外の膜近傍で特異的に切断し、細胞外領域ほぼ全体を可溶化するという翻訳後修飾機構であり、主にADAM（a disintegrin and metalloprotease）ファミリーに属する膜貫通型のメタロプロテアーゼによって担われている。シェディングは１つの切断反応を通じて複数の場所で生理機能を発揮しうる、極めて特徴的で効果的な分子機構であるが、その制御機構に関しては不明な点が多い。そんな中、ある特定の“場”にADAMファミリーと切断される膜タンパク質が共局在することがシェディングの有無を決定していると推測されているので、本研究ではシェディングが起こる場を明らかにするためにシェディングをリアルタイムにイメージングする系を確立することを目指した。まず免疫細胞であるマクロファージが細菌成分であるLPS（lipopolysaccharide）を感知した時にシェディングされることがわかっている膜タンパク質のうち、LPS刺激前後で細胞表面における量が減少するものがあるかFACS解析で検討した所、M-CSF（macrophage colony stimulating factor）受容体の量がLPS刺激後メタロプロテアーゼ活性依存的に激減することがわかった。更に蛍光標識した抗M-CSF受容体を細胞表面に結合させてからLPS刺激をすることで、抗体からの蛍光シグナルが10分以内に消失することがわかった。一方でLPS刺激をしない時には蛍光シグナルは30分以上に渡って持続していた。これらの結果は抗M-CSF受容体抗体を用いることでシェディングをリアルタイムイメージングすることができることを強く示唆している。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] proteomic approach for the elucidation of stimulus- and substrate-specificity of ectodomain shedding. (2013)
  • Author(s): Shirakabe K., Shibagaki Y., Yoshimura A., Koyasu S., Hattori S.
  • Journal Title: J Proteomics Volume: 98 Pages: 233-243
  • DOI: 10.1016/j.jprot.2014.01.012
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] プロテオミクススクリーニングを用いた膜タンパク質シェディングの刺激・基質特異性の解析 (2014)
  • Author(s): 白壁恭子、柴垣芳夫、吉村昭彦、小安重夫、服部成介
  • Organizer: 日本生化学会
  • Place of Presentation: 京都 国際会館
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [Presentation] メタロプロテアーゼ依存的な膜タンパク質シェディングのプロテオミクス解析 (2014)
  • Author(s): 白壁恭子、柴垣芳夫、清木元治、岡田保典、小安重夫、吉村昭彦、服部成介
  • Organizer: 日本病態プロテアーゼ学会
  • Place of Presentation: 大阪 千里ライフサイエンスセンター
  • Year and Date: 2014-08-08 – 2014-08-09
• [Presentation] プロテオミクス解析によるシェディングの刺激・基質特異性の解明 (2013)
  • Author(s): 白壁恭子、柴垣芳夫、吉村昭彦、小安重夫、服部成介
  • Organizer: 日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸国際展示場
• [Presentation] LRRK1はRab7をリン酸化することでautolysosomeの成熟に機能している (2013)
  • Author(s): 池田明加、花房洋、西岡朋生、貝渕弘三、松本邦弘、白壁恭子
  • Organizer: 日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸国際展示場
• [Remarks] 咸臨丸プロジェクト
  • URL: http://www.careerpath-prj.keio.ac.jp/kanrinmaru/scholar/shirakabe/index.html