新規S1P輸送体によって制御される新たなS1Pの生理機能の解明

• Project Area: Machineries of bioactive lipids in homeostasis and diseases
• Project/Area Number: 25116722
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 久野 悠 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 基礎科学特別研究員 (60467636)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2014: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2013: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
• Keywords: 脂質メディエーター / スフィンゴシン1リン酸 / 輸送体 / ゲノム編集 / TALEN / CRISPR/Cas9 system / ゼブラフィッシュ

Outline of Annual Research Achievements

生理活性脂質であるスフィンゴシン１リン酸(S1P)は細胞内で産生された後、輸送体によって細胞外へ供給され、標的受容体に認識されることで様々な生理作用を制御している。これまでに哺乳類では５つのS1P受容体が同定されているが、各S1P受容体の生理機能の特異性や機能的相互作用の全貌解明には至っていない。一方でS1P輸送体は申請者らによってSPNS2が同定されたのみで、その他のS1P輸送体については同定されていない。そこで本研究では新規S1P分泌輸送体の同定及びS1Pの生理機能の解明を目指し、人工ヌクレアーゼであるTALENやCRISPR/Cas9 systemを用いて遺伝子改変ゼブラフィッシュを作成し、その表現型の解析を行う。
TALENやCRISPR/Cas9 systemといった人工ヌクレアーゼはゲノムの標的部位にDNA二本鎖切断を引き起こす。切断部位は細胞の持つ修復機構(非相同末端結合)により修復される際に、切断部位に数塩基の挿入・欠損が高頻度で生じるため、フレームシフトにより標的遺伝子の破壊が引き起こされる。これらの人工ヌクレアーゼを用いて全てのS1P受容体及びS1P合成酵素について遺伝子破壊ゼブラフィッシュを作成したところ、S1P合成酵素の一つであるsphk2変異体においてs1pr2受容体やspns2の変異体と同様の二股心臓の表現型が見られた。spns2やs1pr2変異体と異なり、母親と接合子の両方に由来するsphk2が心臓前駆細胞の遊走制御に必要であった。sphk2 mRNAは発生初期から発現しており、母親から供給されていた。また発生初期における胎児中のS1Pは母親のSphk2に由来することを明らかとした。一方で接合子由来のsphk2は卵黄多核層という胚体外組織に発現していた。これらの結果は卵黄には母親から供給されたS1Pが蓄積しており、この卵黄中S1P及び卵黄多核層で産生されたS1PがSpns2によって胚体へと輸送され、S1pr2受容体に認識されることで心臓前駆細胞の遊走を制御していると考えられる。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. (2015)
  • Author(s): Hisano Y, Sakuma T, Nakade S, Ohga R, Ota S, Okamoto H, Yamamoto T, Kawahara A.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 5 Issue: 1 Pages: 8841-8841
  • DOI: 10.1038/srep08841
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular and physiological functions of sphingosine 1-phosphate transporters (2014)
  • Author(s): Nishi, T., Kobayashi, N., Hisano, Y., Kawahara, A. and Yamaguchi, A
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1841 Issue: 5 Pages: 759-765
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2013.07.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish (2014)
  • Author(s): Satoshi Ota, Yu Hisano, Yohshiya Ikawa, Atsuo Kawahara
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 19 Issue: 7 Pages: 555-564
  • DOI: 10.1111/gtc.12154
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering (2014)
  • Author(s): Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., and Higashijima, S.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 4 Issue: 1 Pages: 6545-6545
  • DOI: 10.1038/srep06545
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish (2014)
  • Author(s): Yu Hisano, Satoshi Ota and Atsuo Kawahara
  • Journal Title: Development, Growth & Differentiation Volume: 56 Issue: 1 Pages: 26-33
  • DOI: 10.1111/dgd.12094
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays (2013)
  • Author(s): Satoshi Ota, Yu Hisano, Michiko, Kazuyuki Hoshijima, Timothy J. Dahlem, David J. Grumwald, Yasushi Okada and Kawahara
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 18 Issue: 6 Pages: 450-458
  • DOI: 10.1111/gtc.12050
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Functional cooperation of spns2 and fibronectin in cardiac and lower jaw development (2013)
  • Author(s): Yu Hisano, Satoshi Ota, Shinji Takada and Atsuo Kawahara
  • Journal Title: Biology Open Volume: 2 Issue: 8 Pages: 789-794
  • DOI: 10.1242/bio.20134994
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Loss-of-function analysis of S1P signaling molecules in zebrafish. (2015)
  • Author(s): Kotani H, Hisano Y, Inoue A, Okudaira M, Ohga R, Okamoto H, Aoki H, Kawahara A.
  • Organizer: 6th International Conference on Phospholipase A2 and Lipid Mediators (PLM2015)
  • Place of Presentation: 東京 京王プラザホテル
  • Year and Date: 2015-02-10 – 2015-02-12
• [Presentation] Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering (2014)
  • Author(s): Kimura Y, Hisano Y, Kawahara A, Higashijima S.
  • Organizer: The 3rd “International Institute for Advanced Studies” Conference of Novel Developments on the Study of Life and Biological Systems Based on Genome Engineering and Imaging Science
  • Place of Presentation: 京都国際高等研究所
  • Year and Date: 2014-10-28 – 2014-10-29
• [Presentation] Exogenous DNA integration into zebrafish genome without indel mutations at the junctions (2014)
  • Author(s): Hisano Y, Okamoto H, Kawahara A.
  • Organizer: The 3rd “International Institute for Advanced Studies” Conference of Novel Developments on the Study of Life and Biological Systems Based on Genome Engineering and Imaging Science
  • Place of Presentation: 京都国際高等研究所
  • Year and Date: 2014-10-28 – 2014-10-29
• [Presentation] CRISPR/Cas9 systemを利用した遺伝子挿入ゼブラフィッシュの作製 (2014)
  • Author(s): 久野悠、太田聡、岡本仁、川原敦雄
  • Organizer: 第４回ゲノム編集研究会
  • Place of Presentation: 広島国際会議場ダリア
  • Year and Date: 2014-10-06 – 2014-10-07
• [Presentation] Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering (2014)
  • Author(s): Kimura Y, Hisano Y, Kawahara A, Higashijima S.
  • Organizer: 20th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 東京 慶應義塾大学薬学部（芝共立キャンパス）
  • Year and Date: 2014-09-20 – 2014-09-21
• [Presentation] Precise genome-editing using CRISPR/Cas9 system (2014)
  • Author(s): Hisano Y, Ota S, Okamoto H, Kawahara A.
  • Organizer: 20th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 東京 慶應義塾大学薬学部（芝共立キャンパス）
  • Year and Date: 2014-09-20 – 2014-09-21
• [Presentation] Genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. (2014)
  • Author(s): Hisano Y, Ota S, Kawahara A.
  • Organizer: 2nd “International Institute for Advanced Studies” Conference of Novel Developments on the Study of Life and Biological Systems Based on Genome Engineering and Imaging Science
  • Place of Presentation: 京都国際高等研究所
• [Presentation] TALEN-mediated gene disruption for analyzing S1P signaling in zebrafish. (2013)
  • Author(s): Hisano Y, Ota S, Muraki M, Kawahara A.
  • Organizer: 19th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 仙台AERビル
• [Presentation] Generation and analysis of S1P receptors-deficient zebrafish using TALEN. (2013)
  • Author(s): Hisano Y, Ota S, Muraki M, Kawahara A.
  • Organizer: FASEB Science Research Conference “Lysophospholipid and Other Related mediators-From Bench to Clinic”
  • Place of Presentation: 北海道ニセコプリンスホテル
• [Presentation] Functional analysis of sphingosine-1-phosphate (S1P) signaling using S1PRs knockout fish. (2013)
  • Author(s): Hisano Y, Ota S, Muraki M, Kawahara A.
  • Organizer: 8th European Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: スペイン、バルセロナ
• [Book] 今すぐ始めるゲノム編集-TALEN＆CRISPR/Cas9の必須知識と実験プロトコール (2014)
  • Author(s): 木下政人、安齋賢、久野悠、川原敦雄
  • Total Pages: 202
  • Publisher: 羊土社
• [Book] 医学のあゆみ「生命を支える脂質―最新の研究と臨床」 (2014)
  • Author(s): 久野悠、川原敦雄
  • Total Pages: 282
  • Publisher: 医歯薬出版株式会社
• [Book] 最新生理活性脂質研究―実験手法、基礎的知識とその応用― (2013)
  • Author(s): 久野悠、川原敦雄
  • Total Pages: 304
  • Publisher: メディカルドゥ